材料和试剂

Nunc cryotube样品瓶（Thermo Scientific，目录号：374502）
细菌培养皿（VWR，目录号：25384-092）
无菌试管（17 x 100 mm，RPI，Research Products International，目录号：168599）
15毫升离心管（VWR，目录号：10025-690）
50毫升离心管（GeneMate，目录号：C-33943-3）
1.7毫升微量离心管（Axygen，目录号：MCT-175-C）
超速离心管（Beckman Coulter，目录号：343778）
血清移液器：5毫升移液器（VWR，目录号：89130-896），10毫升移液器（VWR，目录号：89130-910），25毫升移液器（VWR，目录号：89130-910）
0.1-10μl移液器吸头（GeneMate，目录号：P-1236-10）
20-200μl移液器吸头（GeneMate，目录号：P-1236-200）
101-1,000μl移液器吸头（GeneMate，目录号：P-1236-1250）
0.2μm过滤器（Millipore，型号; Millex GP ，目录号：202012）
铝箔
通用包装（Fisher Brand，目录号：15-610）
丁腈橡胶或乳胶手套（VWR，目录号：89038-270）
显微镜载玻片（Corning，目录号：2947-75X25）
厚斑纸（Bio-Rad，目录号：1703965）
携带质粒pET23 /42FLAGMurJΔcysThrombin（Natividad Ruiz博士菌株数据库）衍生物的大肠杆菌交联菌株（Kumar et al。，2019）
注意：这些菌株将根据目标蛋白质和质粒而异。
Immun-Blot PVDF膜（Bio-Rad，目录号：1620177）
Trans-Blot SD半干转移细胞（Bio-Rad，目录号1703848）
冰
蒸馏无菌水（dH 2 O）
LB Broth，Lennox（Fisher Scientific，目录号：BP1427-2）
Difco-Agar Bacteriological（BD，目录号：BD-214510）
氨苄青霉素钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：A9518-5G）或其他适用于选择编码其他靶蛋白的质粒的抗生素
1,6-双（马来酰亚胺基）己烷（BMH; Thermo Scientific Pierce，目录号：22330）
1,2-双（马来酰亚胺基）乙烷（BMOE; Thermo Scientific Pierce，目录号：22323）
o -PDM（Sigma-Aldrich，目录号：104590-5G）
L-半胱氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：168149-5G）
溶菌酶（Amresco，目录号：0663-5G）
Benzonase（Sigma-Aldrich，目录号：E1014 5KU）＆nbsp;
来自牛血浆的凝血酶（Sigma-Aldrich，目录号：T6634-100UN）＆nbsp;
乙二胺四乙酸二钠二水合物（EDTA）（Sigma-Aldrich，目录号：E5134-1KG）
氯化钙（CaCl 2 ）（Sigma-Aldrich，目录号：223506-500G）
过硫酸铵（Amresco，目录号：0486-100G）
N-十二烷基-β-D-麦芽糖苷（DDM; Affymetrix，目录号：D310S）
氯化镁（MgCl 2 ）（Sigma-Aldrich，目录号：T6634-100UN）
柠檬酸三钠二水合物（Sigma-Aldrich，目录号：C8532-1KG）
磷酸氢二钠七水合物（Na 2 HPO 4 ·7H 2 O）（Amresco，目录号：0348-1KG）
磷酸二氢钠（NaH 2 PO 4 ）（Fischer Scientific，目录号：S397-500）
氯化钠（NaCl）（Sigma-Aldrich，目录号：59888-2.5KG）
PEG-8000（Sigma-Aldrich，目录号：89510-250G）
蔗糖（Amresco，目录号：0335-1KG）
二甲基亚砜（DMSO）（Amresco，目录号：0231-500ml）
Tris（GoldBioCom，目录号：T-4005-5）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：62862-1KG）
尿素（Ameresco，目录号：0568-1KG）
溴酚蓝钠（Amresco，目录号：0312-50G）
甘油（Sigma，目录号：G7893）
β-巯基乙醇（Amresco，目录号：0482-250ml）
丙烯酰胺（Protogel）（国家诊断，目录号：EC-890）＆nbsp;
甘氨酸（Fisher Scientific，目录号：BP381-5）
四甲基乙二胺（TEMED）（Bio-Rad，目录号：161-0800）
即食脱脂奶粉
抗FLAG M2（Sigma-Aldrich，目录号：F3165）
甲醇（Fisher，目录号：A412P-4）
吐温20（Amresco，目录号：0777-1L）
ECL TM 抗小鼠IgG，辣根过氧化物连接的全抗体（来自绵羊）（GE healthcare，目录号：NA931V）
Clarity Western ECL底物（Bio-Rad，目录号：1705061）
原生质球缓冲液（见食谱）
凝血酶反应缓冲液（见食谱）
凝血酶重建缓冲液（见食谱）
Benzonase稀释缓冲液（见食谱）
2x AB样品缓冲液（参见食谱）
磷酸盐缓冲盐水（1x PBS;参见食谱）
10x SDS-PAGE运行缓冲液（参见食谱）
1x转移缓冲液（见食谱）
10x TBS缓冲液（见食谱）
1x TBS + 0.1％吐温20（1x TBST）（见食谱）
5％牛奶TBST（见食谱）
1 M L-半胱氨酸（见食谱）
马来酰亚胺同双功能交联剂（见食谱）

设备

显微镜（尼康，型号：Eclipse E200）
pH计（Thermo scientific，型号：STARA1110）
37°C孵化器（Fisher Scientific，型号：isotemp）
滚筒（Eppendorf，New Brunswick TM ，型号：TC-7）
4°C冰箱
-20°C冰柜
-80°C冰箱
250毫升烧瓶（Pyrex USA，目录号：4980）
平台振动筛
称重平衡（Mettler Toledo，型号：ML32002E / 03和AE163）
0.5-10μl移液器（USA Scientific，型号：Ergo One，目录号：7100-0510）
2-20μl移液器（USA Scientific，型号：Ergo One，目录号：7100-0220）
20-200μl移液器（USA Scientific，型号：Ergo One，目录号：7100-2200）
100-1,000μl移液器（USA Scientific，型号：Ergo One，目录号：7110-1000）
PIPETMAN ®（JENCONS，型号：Powerpippette plus）
台式离心机（Eppendorf，型号：5810R）
高速微量离心机（Eppendorf，型号：5418）
Clay Adams Nutator（Marshal Scientific，catalaog编号：CANU）
超速离心机（Beckman Coulter，型号：OptimaMax-TL ultra）
超速离心机固定角度转子（Beckman Coulter，型号：TLA120.2）
ChemiDoc TM XRS + 成像系统（Bio-Rad）
Biowave个人细胞密度计（Biochrome，目录号：5300-06）
Vortex Genie 2（科学工业，目录号：SI-0236）
Mini-PROTEAN ® Tetra Handcast Systems（Bio-Rad，目录号：1658004）
PowerPac Basic电源（Bio-Rad，目录号：1645050）

软件

ImageLab（Bio-Rad）
PyMOL（版本2.0.1，Schrodinger）

程序

注意：完整的协议如图3所示。

图3.使用马来酰亚胺同型双功能交联剂体内半胱氨酸交联的示意性逐步方案

E的成长。大肠杆菌交联菌株
注意：内向开放状态的晶体结构和预测目标蛋白向外开放状态的计算机内同源模型指导我们使用定点诱变选择用半胱氨酸替换的残基。我们选择残基对，使得当目标蛋白仅采用两种构象状态中的一种时，它们的Cα位置之间的距离将在同源双功能交联剂的臂长内。基于此策略，我们构建了 E.大肠杆菌交联菌株，每个都含有编码靶蛋白的双半胱氨酸变体的质粒。在我们最近的研究中可以找到选择半胱氨酸取代和同型双功能交联试剂残基的详细实验原理，以及双半胱氨酸变体的构建（Kumar et al。，2019）。
1. 将储存在 E的-80°C的冷冻储存条纹。大肠杆菌交联菌株，每个菌株都含有编码靶蛋白双半胱氨酸变体的质粒（pET23 /42FLAGMurJΔcysThrombin衍生物用于本方案）（Kumar et al。，2019），在LB琼脂平板上补充125μg/ ml氨苄青霉素。
  注意：抗生素氨苄西林选择质粒维持，因此请根据所用的质粒系统进行替换。
2. 将板在37℃孵育过夜。
3. 使用单个菌落接种5ml补充有125μg/ ml氨苄青霉素的LB培养基，并在37℃下在滚筒中以56rpm的最高速度旋转培养过夜。
4. 用来自步骤A2的1ml培养物接种50ml LB培养基（在250ml Erlenmeyer烧瓶中），并在37℃下以200rpm振荡培养培养物，直至其OD 600 为1。
  注意：在培养这种二级培养物时可以使用适当的抗生素来维持质粒，但由于培养时间短，它们不是必需的。
制备用于与双 - 双功能交联剂交联的样品
1. 转移所需的 E卷。将步骤A4中的大肠杆菌培养物转移到50ml离心管中。
  注意： E所需的音量。大肠杆菌培养物（以ml计）应等于10乘以处理次数，其中处理次数表示使用的不同交联剂的数量加上未使用任何交联剂处理的交联剂的数量（消极控制）。
2. 在室温下在离心机中以2,057×g离心培养样品5分钟。
3. 弃去上清液，用一定体积的LB肉汤（相当于500μl）乘以处理次数（即，交联剂数加1）重悬细胞沉淀。
4. 涡旋样品以确保正确混合并将500μl每个重悬浮的细胞沉淀物转移到新的1.7ml微量离心管中。
与同双功能交联剂交联
注意：在实验之前，从-20°C中取出所有交联剂的原料，让它们升温至室温。在我们的实验中，我们使用了1,6-双（马来酰亚胺基）己烷（BMH;它具有灵活的16-Å间隔臂长度），1,2-双（马来酰亚胺基）乙烷（BMOE;具有柔性8-Å间隔物）臂长）和N，N' - （邻 - 亚苯基）二马来酰亚胺（o-PDM;其具有刚性的6-spacer间隔臂长度）。我们使用马来酰亚胺交联剂，因为它们在水性环境如周质和细胞质中具有反应性，并与半胱氨酸的巯基形成硫醚键，这些巯基可通过还原剂逆转（图4）（Mulligan 等人。，2017）。除非另有说明，否则在室温下执行所有步骤。
1. 将10μlDMSO加入含有重悬细胞的微量离心管中，该细胞标记为“阴性对照”。
  注意：在这种情况下使用DMSO是因为DMSO是用于溶解交联剂的溶剂。
2. 向每个剩余的含有重悬浮细胞的微量离心管中加入10μl50mM交联剂原液（BMH，BMOE， o -PDM），终浓度为1mM。 /> 注意：应优化交联剂的最终浓度，因为它可能因目标蛋白质而异。
3. 涡旋所有样品。
4. 将样品管放在室温下的章动器上，并用铝箔覆盖。
  注意：样品被箔覆盖，因为一些交联剂对光敏感。
5. 在室温下将样品在黑暗中孵育5分钟，然后在章动器上摇动。
  注意：应优化与交联剂的孵育时间，因为它可能因目标蛋白质而异。
6. 每个样品中加入50μl0.1M L-半胱氨酸（终浓度10 mM）。
  注意：提供过量滴定任何未使用的交联剂的半胱氨酸。储存在-20°C的L-半胱氨酸储备溶液应在加入前一小时内解冻至室温。
7. 涡旋所有样品。
8. 在室温下在章动器上孵育5分钟。
9. 每个样品中加入1 ml 1x PBS。
10. 在台式微量离心机中以15,777 x g离心1分钟。
11. 弃去上清液，将每个细胞沉淀重悬于500μl50mMTris（pH8）中。
图4.马来酰亚胺交联剂与靶蛋白上半胱氨酸的巯基之间的反应。交联剂的马来酰亚胺部分与半胱氨酸残基上存在的巯基（-SH）反应形成稳定的硫醚键，不能通过还原剂逆转。 R基团在交联剂中有所不同，包括间隔臂和另一个马来酰亚胺基团。
分离含有靶蛋白的细胞质膜
1. 对于原生质球形成，将每个样品从步骤C11转移到新的15毫升离心管中。
  注意：在原生质球形成期间， E的外膜和肽聚糖细胞壁。大肠杆菌细胞被破坏，但它们的细胞质膜保持完整。
2. 加入500μl原生质球缓冲液。
3. 加入2.5μl100mg / ml溶菌酶原液。
4. 加入1毫升dH 2 O.
5. 在室温下孵育15分钟。在15分钟孵育期间，在低设定下轻轻涡旋几次以均匀混合。
6. 加入50μl1MMgCl 2 。
7. 将3μl每种样品转移到显微镜载玻片上，在40x物镜下观察样品以确认原生质球形成。
  注意：原生质球表现为大而明亮的圆形细胞。均匀的原生质球形成是必要的。如果没有，应优化室温下的孵育时间。
8. 通过在4℃下在2,057×g g / min离心5分钟收集原生质球。
9. 弃去上清液，并将原生质球重悬于500μl冰冷的50mM Tris（pH 8）中。
10. 将每个重悬浮的原生质球样品转移到单独的预冷超速离心管中。
  注意：此步骤应在冰上进行，以尽量减少目标蛋白的降解。
11. 加入1μl25U /μlBenzonase原液。
12. 小心地上下移液，搅拌均匀。
13. 在4℃下在Optima-MAX-TL超速离心机（Beckman Coulter）中使用TLA120.2转子在434,902 x g 离心1小时以沉淀膜。
14. 弃去上清液，将膜沉淀重悬于150μl凝血酶反应缓冲液中。＆nbsp;
15. 加入15μl10％DDM原液（终浓度1％）。
  注意：1％DDM用于溶解我们的目标蛋白质。但是，洗涤剂的选择可能因目标蛋白质而异。
16. 将重悬的膜制剂转移到预先冷却的1.7ml微量离心管中。＆nbsp;
17. 在台式微量离心机中于4℃以15,777 离心10分钟离心10分钟以除去未增溶的或聚集的蛋白质。
18. 对于每个样品，将上清液转移到单独的微量离心管中。
凝血酶治疗
1. 对于步骤D18中的每个样品，将50μl转移到两个单独的微量离心管中。
2. 向每个处理的一个微量离心管中加入4μl0.1U/μl凝血酶原液（终浓度0.4U），另一个未处理。
  注意：冻干凝血酶粉末应首先在凝血酶重构缓冲液中重建为0.1 U /μl，然后再使用。将库存保存在-20°C
3. 将所有样品在室温下孵育20小时。
  注意：应优化孵育时间和温度以确保所有目标蛋白的切割。
4. 向所有样品中加入50μl2xAB缓冲液。
  注意：此步骤停止蛋白水解反应并制备用于电泳的样品。我们的蛋白质样品使用2x AB缓冲液;但是，根据目标蛋白质，可以使用其他类型的SDS-PAGE上样缓冲液。
5. 在室温下在台式离心机中以15,777 x g 离心10秒钟，在微量离心管底部收集样品。
SDS-PAGE和免疫印迹
1. 在Mini-PROTEAN ® Tetra系统中组装10％SDS-PAGE凝胶。
  注意：SDS-PAGE凝胶的％应根据目标蛋白的分子量及其凝血酶蛋白水解切割模式来确定。
2. 在10％SDS-PAGE凝胶上加载25μl来自步骤E5的每种样品。这样做时，每个处理的每个凝血酶处理/未处理的对加载，有或没有特定的交联剂。
  注意：等量的样品应加载到凝胶上，因为在使用等量的培养物达到相同的OD 600 后，在步骤B4收集相同数量的细胞。然而，在将样品加载到凝胶上之前，测量蛋白质浓度的方法也可用于标准化。
3. 使用1x SDS-PAGE运行缓冲液在120V下开始电泳，并在可见分子量标记物迁移所需距离后停止。
4. 使用半干转移装置（Bio-Rad）将蛋白质从凝胶转移到10V的聚偏二氟乙烯（PVDF）膜上2.5小时。
  注意：转移时间和电压应根据目标蛋白质和％SDS PAGE凝胶进行优化。
5. 用平台振荡器在室温下用5％牛奶在TBST中封闭PVDF膜30分钟。
6. 用一抗探测PVDF膜。
  注意：对于我们的目标蛋白，我们用抗FLAG M2（1：10,000; Sigma-Aldrich）在含有5％牛奶的TBST中通过在4℃下在振荡器上孵育过夜进行探测。
7. 用1x TBST洗涤三次，在室温下在振荡器上孵育5分钟。
8. 用二抗探测PVDF膜。
  注意：对于我们的靶蛋白，我们使用抗小鼠辣根过氧化物酶缀合的抗体（1：10,000; GE Healthcare）在含有5％牛奶的1x TBST中通过在室温下在振荡器上孵育1小时进行探测。 EM>
9. 用1x TBST洗涤三次，在室温下在振荡器上孵育5分钟。
10. 根据制造商的说明书（Bio-Rad）使用Clarity Western ECL底物显色信号，并使用ChemiDoc XRS +系统（Bio-Rad）中的Image Lab程序检测。

数据分析

使用具有不同间隔臂的含马来酰亚胺的交联剂进行的体内半胱氨酸交联实验应探测N-叶中周质和细胞质残基中取代的半胱氨酸残基的接近度。靶蛋白的C-叶并测试向内和向外开放构象的存在（图5A和5B）。蛋白水解凝胶分析的结果应分析如下：

在缺乏蛋白酶处理的任何样品中，只应检测全长蛋白质变体。
在没有发生交联的蛋白酶处理的样品中，因为没有加入交联剂或两个半胱氨酸太远而不能交联，所以靶蛋白应该被切割成两个片段。这应该通过免疫印迹后缺少对应于全长蛋白质的条带来反映（图5C和5D）。具有较高丙烯酰胺百分比的凝胶可用于确认较小标记片段的检测（图2A）。
在由半胱氨酸对通过同型交联试剂交联的细胞制备的蛋白酶处理的样品中，即使在蛋白酶切割后也应检测全长蛋白质，因为两个叶片应保持由交联剂共价连接（图5C和5D）。该结果应解释为表示两个半胱氨酸残基在运输循环期间进入特定交联剂的可交联距离内。对应于全长蛋白质的条带强度应与交联量成比例。两个半胱氨酸之间的交联效率可以在交联剂之间变化，因为它将取决于这些残基之间的距离和各种交联剂的间隔臂的长度。

在我们的实验中，在周质或细胞质侧含有特定半胱氨酸取代的变体的交联和蛋白酶处理后存在或不存在全长蛋白质，证明存在两种构象：内向和外向开放构象。目标蛋白的运输周期。

图5. 体内双半胱氨酸交联结果。两个半胱氨酸各自位于靶蛋白的N叶和C叶面向周质（P）或细胞质（C）与马来酰亚胺同双功能交联剂交联，仅在两个中的一个构象：面向周质的半胱氨酸的内向开放构象（图A）或面向细胞质的半胱氨酸的向外开放构象（图B）。 C.凝血酶处理后，如果没有发生交联，则在免疫印迹后将看不到全长蛋白质（左侧的模拟印迹）。如果发生交联（右侧模拟印迹），即使在凝血酶处理后也会检测到全长蛋白质。 D.靶蛋白与二甲基亚砜（DMSO）作为阴性对照和三种不同的间隔臂长度的马来酰亚胺同双功能交联剂（1,6-双（马来酰亚胺基）己烷（BMH）的交联实验结果，具有灵活的16-Å间隔臂长度），1,2-双（马来酰亚胺基）乙烷（BMOE，具有灵活的8-Å间隔臂长度）和 N ， N ' - （ o - 亚苯基）二马来酰亚胺（ o -PDM，具有刚性的6-Å间隔臂长度）。

笔记

我们的方案可以应用于利用交替进入机制的其他转运蛋白。此外，该方案还可以与不是转运蛋白的蛋白质一起使用，以探测可能受调节的结构域之间的动态相互作用。
应在使用前测试所有靶蛋白变体功能的证明，因为验证交联结果至关重要。
在半胱氨酸交联之前，有必要通过合适的方法检查靶蛋白变体的表达水平。
强烈建议包括阴性对照以验证该过程的技术细节。例如，推荐靶蛋白的无半胱氨酸变体，单半胱氨酸变体的使用和面向彼此相对侧的双半胱氨酸突变体（Kumar 等，，2019）。
尝试每次新鲜制备马来酰亚胺同双功能交联剂的原料以获得最佳结果（交联剂的反复冷冻和解冻可能影响结果）。
我们设计了靶蛋白的功能变体，其含有众所周知的蛋白酶位点（凝血酶）。还可以使用另一种蛋白酶位点，例如因子Xa蛋白酶（Sun和Kaback，1997）。但是，应注意蛋白酶处理不会引起靶蛋白的非特异性切割。
为确保重现性，检测应一式三份进行。
我们的方案也可用于测试小分子抑制剂转运蛋白的作用，就像我们研究质子细胞对MurJ的影响一样（Kumar et al。，2019）。

食谱

原生质球缓冲液
50mM Tris-HCl，pH 8.0
1 M蔗糖
2 mM EDTA
凝血酶反应缓冲液（将缓冲液保存在4°C）
50mM Tris-HCl，pH 8.0
150 mM NaCl
2.5mM CaCl 2
凝血酶重建缓冲液
50 mM柠檬酸钠，pH 6.5
200mM NaCl，0.1％PEG-8000,50％甘油
注意：使用此缓冲液通过产生0.1 U /μl凝血酶原液（-20°C储存库存）重构凝血酶。
Benzonase稀释缓冲液（将缓冲液保存在-20°C）
50mM Tris-HCl，pH 8.8
2 mM MgCl 2
50％甘油
注意：在使用之前，将此缓冲液中的Benzonase稀释至25 U /μl。
2x AB样品缓冲液
6.84mM Na 2 HPO 4
3.16 mM NaH 2 PO 4
50mM Tris-HCl，pH 6.8
6 M尿素
1％β-巯基乙醇
3％SDS
10％甘油
0.1％溴酚蓝
1x PBS
8mM Na 2 HPO 4 ·12H 2 O，2 mM NaH 2 PO 4 ·2H 2 O，131 mM NaCl在dH 2 O
10x SDS-PAGE运行缓冲液
在1,000ml dH 2 O中加入30.0g Tris碱，144.0g甘氨酸和10.0g SDS
1x转移缓冲液（1 L）
5.82克Tris
2.93克甘氨酸
200毫升甲醇
800毫升dH 2 O.
10x TBS缓冲区
一个。将24克Tris和88克NaCl溶于900毫升蒸馏水中
湾用12N HCl将pH调节至7.6
C。添加dH 2 O至最终体积为1L
注意：使用时稀释至1倍。
1x TBST（1x TBS + 0.1％吐温20）（1L）
50毫升20倍TBS
1毫升吐温20
950ml dH 2 O.
5％牛奶TBST（25毫升）
1.25克干奶粉
25毫升1×TBS + 0.1％吐温20
1 M L-半胱氨酸
在1ml dH 2 O中的121mg L-半胱氨酸注意：将原料储存在-20°C的等分试样中，解冻后不应重新冷冻。
马来酰亚胺同双功能交联剂
50mM BMH：在500μlDMSO中6.875mg BMH
50mM BMOE：在500μlDMSO中5.5mg BMOE
50 mM o -PDM：6.7 mg o -PDM在500μlDMSO中
注意：将储存溶液储存在-20°C，用铝箔包裹。

致谢

我们感谢Rebecca M. Davis帮助准备这份手稿。这项工作得到了国家普通医学科学院向国家研究所提供的GM1000951资助。一些数字的部分内容根据我们之前的研究进行了调整和修改（Kumar et al。，2019）。
＆NBSP;该协议改编自Kumar，S.，Rubino，F.A.，Mendoza，A.G。和Ruiz，N。（2019）。细菌脂质II翻转酶MurJ通过交替进入机制起作用。生物化学杂志 294,981-990。

利益争夺

作者声明没有潜在的利益冲突。

参考

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