材料和试剂

无菌通用移液器吸头（Scharlab，S.L。，目录号：000P0210-1 [0.5μl-10μl]; 00PC5200-1 [10-100μl]; 000P1000-1 [100-1,000μl]）
1.5 ml微量离心管（Labbox Labware S.L.，目录号：PCRP-015-500）
流式细胞仪管（Sarstedt，目录号：55.1579）
注射器0.2μm过滤器（赛多利斯，Minisart R ，目录号：16534-k）
注射器和针头（ICOplus3，Novico，目录号：164624.8）
Simport Cryovial（Simport TM Scientific，目录号：T310-5A）
Bemis Parafilm M（Bemis，目录号：PM996）
聚碳酸酯膜过滤器
焦磷酸钠四元酸（Na 4 P 2 O 7 ）（Sigma-Aldrich，目录号：P8010）
吐温20，聚氧乙烯山梨糖醇酐单月桂酸酯（C 26 H 50 O 10 ）（Sigma-Aldrich，目录号：P1379）
Nycodenz 60％（w / v）（C 19 H 26 I 3 N 3 O 9 ）（NycoPrep TM Universal，Axis-Shield，目录号：31000.01）＆nbsp;
Milli-Q水
多聚甲醛和戊二醛
1. 多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：P6148-500G）
2. 戊二醛25％（Scharlau，目录号：GL01701000）
3. 磷酸盐缓冲盐水片（Sigma-Aldrich，目录号：P4417）
护套液（BD FACSFlow，目录号：342003）
SYBR Green I（西格玛奥德里奇，目录号：S9430）
二甲基亚砜（DMSO）（C 2 H 5 OS）（Sigma-Aldrich，目录号：472301）
Latex1μm-beads（Polysciences，目录号：18860-1）
磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液
焦磷酸钠四价原液（见食谱）
多聚甲醛和戊二醛溶液（见食谱）
SYBR Green I解决方案（见食谱）

设备

Eppendorf移液器（0.5-10μl，10-100μl，100-1,000μl）
玻璃烧杯
WiseStir电磁炉搅拌器（MSH-20A）
用于分离程序的涡旋混合器（Velp scientifica，目录号：F202A0173）
用于分离程序的超声波清洁器（P. Selecta，Ultrasons）
冷冻离心机（Eppendorf Microcentrifuge，型号：5415R）
光源（灯）
用于流式细胞仪的超声波清洗器（Bransonic，型号：200）＆nbsp;
用于流式细胞仪的涡旋混合器（VWR International）
流式细胞仪（Becton，Dickinson and Company，BC Biosciences，BD FACSCalibur TM ）
冷冻室-80°C（Thermo Scientific TM ，Herafreeze TM ，型号：SAT 901120200，目录号：HFU686BA）

软件

BD CellQuest TM Pro Software（Becton Dickinson and Company， https://www.bd.com/en-uk/products/molecular-diagnostics/cytometric-analysis-products ）

程序

该方法将细菌和病毒与气溶胶（灰尘和有机聚集体）颗粒分离，用于流式细胞计数（Reche et al。，2018）。它类似于Amalfitano和Fazi（2008）用于附着于河床沉积物的底栖细菌的程序。在这种分离程序之后，细菌不附着，分散在无菌的MilliQ-水中，然后，它们可以通过流式细胞术容易地计数，代表与大气颗粒相关的细菌总数。大气样本来自干燥和潮湿的收集器。我们将3ml样品置于5ml-criovials中，在田间用多聚甲醛和戊二醛（10％+ 0.05％终浓度）固定，在液氮中冷冻，并将它们保持在-80℃直至分析。使用无菌Milli-Q水从收集器中回收干沉积物。关于干燥和湿收集器的更多细节可以在Reche 等人（2018）中找到。
＆NBSP;在这里，我们主要揭示了细菌计数的步骤（Gasol和Del Giorgio，2000），但是前面关于回收微生物层的步骤对于病毒也是常见的。

细菌分离程序
1. 在1.5 ml微量离心管中取718μl大气沉降样品。该等分试样含有游离的和附着于颗粒的细菌。
2. 加入56.4μl螯合剂焦磷酸钠（ ca。 0.1％终浓度）的工作溶液（参见配方）和7.5μl洗涤剂Tween 20（0.5％终浓度）以减少细菌附着在气溶胶的矿物和有机颗粒上（图1A）。
  
  图1.分离程序的不同步骤的方案。 A.使用焦磷酸钠作为螯合剂和吐温20作为洗涤剂的化学处理。 B.物理处理摇动样品和超声波浴。光盘。使用Nycodenz纯化微生物层以产生四层密度梯度。 E-F。选择微生物层并将其悬浮在灭菌的Milli-Q水中，直至冷冻管中的初始样品体积。
3. 在涡旋中以~720rpm摇动样品30分钟（图1B），并将它们置于超声浴中1分钟以将附着的细菌分散到液相中。重要的是不要将样品放置在超声波浴中超过1分钟，以防止在分离过程中细胞损坏。
4. 仔细地放置约。使用足够长的针到达1.5ml微量离心管底部的718μlNycodenz处理样品下方（图1C）。带有Nycodenz的注射器不应干扰微量离心管的内容物或有气泡。这对于正确形成密度梯度很重要。
5. 使用Nycodenz作为培养基，以4,000℃（图1D）以14,000 xg 离心微量离心管90分钟，以分离四个密度层（自上而下）：上清液，微生物层，Nycodenz和颗粒（图1E）。颗粒并不总是可见的。颗粒的观察取决于大气沉降中的颗粒负荷，主要是在大气沉降中含有撒哈拉沙尘时观察到的。
  
  图2.微量离心后微量离心管的背光图（步骤5之后）。步骤5后，微量离心机有四层（自上而下）：上清液，微生物层，Nycodenz和灰尘颗粒。
6. 使用背光识别微生物层（图2，视频1），并使用移液管的尖端（图1E，视频2）小心地完成这一层。＆nbsp;
7. 将微生物层（200μl）置于冷冻管中，并将其悬浮于518μl灭菌的Milli-Q水中以达到初始体积（718μl）（图1F）。然后，再次用多聚甲醛和戊二醛（终浓度1％+ 0.05％）固定样品，并将其保存在-80°C直至流式细胞仪分析。
  
  视频1.背光视频移动微量离心管，以清楚地识别微生物层的对比，乳状结构
  
  视频2.背光视频以显示检索微生物层的过程
通过流式细胞术进行细菌计数
1. 细胞计数器清洁后，每个工作日校准细胞计数器的流量。首先，称量含有Milli-Q水的管，该值是mg（=μl）的初始重量（ W initial ），然后运行此Milli-Q水样在细胞计数器中以低流速进行10分钟，并再次称重管，该值是mg（=μl）的最终重量（ W 最终）。其次，使用下一个等式估算工作流程。该工作流程通常为33.6μlmin -1 至42.2μlmin -1 。
2. 设置流式细胞仪，激发波长为448 nm，荧光侧向散射（SSC）和前向散射（FSC）参数为对数刻度，绿色荧光阈值（FL1-H），然后运行Milli-Q水样。将事件保持在非常低的水平（不必检测绿色荧光）。
3. 将样品解冻并在流式细胞仪管中一式三份制备500μl等分试样，加入5μlSYBRGreen I（1：1,000）染色细菌，涡旋细胞计数管并在黑暗中于25°C孵育10分钟，加入10μl荧光乳胶珠悬浮液（浓度1×10 5 ）作为内参照，然后以低流速运行样品。首先，运行Milli-Q水样作为阴性对照，然后运行实验样品直至获得大约10000个事件。事件必须在每秒200到800之间，以避免巧合。当事件高于每秒800次时，必须稀释样品。
4. 使用软件BD CellQuest Pro保存数据以便进一步处理。

数据分析

使用BD CellQuest Pro软件进行细胞图的数据分析。使用它们在双变量图中的标记（绿色荧光FL1-H对比侧光散射SSC）以及区分细菌位置和大小的预选门来鉴定细菌细胞。分离程序的成功是常规控制的。在没有分离程序（图3A和3C）和在该程序之后（图3B和3D）计数相同的样品。提交给分离程序的样品代表总的（游离的和大气颗粒附着的）细菌。

图3.没有脱离处理和进行此处理后相同样品的细胞图比较。 A-B。大西洋影响的气象情景下的湿沉积样品的细胞图，没有分离程序（A）和在提交分离程序（B）之后。光盘。在没有拆卸程序（C）和提交拆卸程序（D）之后，在撒哈拉沙尘侵入的气象情景下湿沉积样品的细胞图。 x轴对应于侧光散射（SSC），y轴对应于绿色荧光（FL1-H）。 R2矩形是细菌计数的选定区域。该地区以外的活动是杂质。

笔记

Nycodenz必须在20°C或更低温度下储存，并保护光线。
乳胶珠必须在-20°C下储存，珠子悬浮液必须在超声波浴中孵育10分钟，然后用流式细胞仪进行计数。

食谱

焦磷酸钠四元素
储备溶液的制备（1M）：＆nbsp;
1. 称取26.59g焦磷酸钠四元酸并在100ml无菌Milli-Q水中稀释
2. 准备工作溶液（0.1 M），取10 ml原液，并在100 ml无菌Milli-Q水中稀释
多聚甲醛和戊二醛溶液（终浓度1％+ 0.05％）
1. 在玻璃烧杯中加入100克多聚甲醛（Sigma，P6148）至880毫升Milli-Q水中，并用Parafilm覆盖
2. 使用磁力搅拌器在90℃的加热板上将多聚甲醛溶解24小时至72小时，在通风橱下进行。水必须接近沸点
3. 加入100ml磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液。预先通过将PBS片剂（Sigma，P4417）溶解在200ml Milli-Q水中来制备该溶液。
4. 加25毫升戊二醛溶液25％
5. 通过聚碳酸酯膜过滤器（直径25 mm，0.2μm）过滤，在冷冻瓶中取5-20 ml等分试样并储存在-80°C（长期储存）或-20°C（工作溶液）
SYBR Green I解决方案（1：1,000）
用DMSO将SYBR Green I稀释至1：1,000，并在-20°C下保存，避光。

致谢

这项工作得到了西班牙经济和竞争力部（项目CGL2015-73250-JIN）的支持，并获得了格拉纳达大学研究和转移副研究员到CMA的硕士研究生奖学金。我们还要感谢GustavoOrtizFerrón博士对流式细胞仪的指导。该程序先前在Reche 等人（2018）中使用，并且是Amalfitano和Fazi（2008）对流化床沉积物的程序的大气颗粒的适应性。

利益争夺

作者宣称没有竞争利益。

参考

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Fröhlich-Nowoisky，J.，Kampf，CJ，Weber，B.，Huffman，JA，Pöhlker，C.，Andreae，MO，Lang-Yona，N.，Burrows，SM，Gunthe，SS，Elbert，W.，Su ，H.，Hoor，P.，Thines，E.，Hoffmann，T.，Després，VRandPöschla，U。（2016）。地球系统中的生物气溶胶：气候，健康和生态系统的相互作用。 Atmos Res 182：346-376。
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