材料和试剂

的Kimwipes
封口膜
疏水标记（Elite PAP Pen，Diagnostic Biosystems参考：K039）
1.5毫升Microcentrifuge管
Columbia Jars（DWK Life Sciences Wheaton TM Columbia Jars for Coverslips，目录号：02-912-637）
10μl接种环
培养管（硼硅酸盐玻璃管13 x 100 mm项目）（Globe Scientific，目录号：1510）
微管吸头
显微镜载玻片
盖玻片（22 x 22 mm正方形，0.13 mm至0.16 mm厚）（Corning，目录号：2845-22）
一次性培养皿60 x 15 mm（VWR ®，目录号：25384-164）
Whatman ®定性滤纸，1级（Whatman，目录号：1001 125）
Chlamydomonas 菌株
注意：野生型菌株CC-125交配型+来自 Chlamydomonas 资源中心（明尼苏达大学）。
Atto 488鬼笔环肽（Sigma，目录号：49409），储存于-20°C，避光
聚L-赖氨酸溶液（Sigma，目录号：P8920）
PBS片剂（Research Products International PBS 100 ml Tablets SKU P32080-100T）
PFA水溶液16％（电子显微镜科学，目录号：15710）
HEPES（康宁，目录编号：61-034-RM）
NaOH颗粒（J.T. Baker，目录号：3722）
HCl（Fischer Chemical，目录号：A481-212）
丙酮（组织学）（Fisher Chemical，目录号：A16P-4）
Fluoromount-G TM （Invitrogen，编号：00-4958-02）
去水
BD Biosciences Difco TM 琼脂，颗粒状（参考号：214530）
猎人的微量元素（可以从 Chlamydomonas 资源中心订购）
乙酸，冰川（认证ACS）（Fisher化学，目录号：A35S-500）
甲醇
Tris碱（C 4 H 11 NO 3 ），超纯
氯化铵（NH 4 Cl）
硫酸镁七水合物（MgSO 4 ·7H 2 O）
二水氯化钙（CaCl 2 ·2H 2 O）
磷酸氢二钾无水（K 2 HPO 4 ）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）
1x PBS（见食谱）
7.5 mM HEPES缓冲液中4％PFA（参见食谱）
鬼笔环肽原料制剂（见食谱）
TAP液体培养基（Tris Acetate Phosphate Media）（见食谱）
1. 100x Tris缓冲液（见食谱）
2. 100x TAP盐（见食谱）
3. 1000x磷酸盐溶液（见食谱）
1.5％TAP琼脂平板（见食谱）

设备

化学铲
刻度量筒
烧杯
搅拌盘
搅拌棒
pH计
规模
镊子
移液器
Gusto ®高速迷你离心机（Heathrow Scientific，目录号：HEA10050）
空手套箱，盖遮挡样品避光
用于图像采集的显微镜（我们使用配备QiIMAGING QICAM的Nikon Eclipse Ti-S）
滚筒（Cel Gro Tissue Culture Rotator）（Thermo Scientific，目录号：1640Q）
-20°C冰柜

软件

惠更斯必备（科学体积成像）
ImageJ（Schneider et al。，2012）

程序

细胞培养和实验装置
1. 从Tris醋酸磷酸盐（TAP）琼脂平板上取2个Tris醋酸磷酸盐（TAP）液体培养基，在滚筒（40转/分钟）上培养两个接种CC-125交配型+细胞的接种环（~16小时））在室温下生长照明。
2. 第二天，建立一个封口膜工作区（图2）。使用疏水标记在盖玻片上绘制一个圆圈，最后将移液细胞以及实验中使用的所有未来培养基。确保每次试验都适当地标记盖玻片，我们发现在每个盖玻片的角落写上“F”有助于从后面表示正面。在室温下将200μl聚-L-赖氨酸加入疏水环中，10分钟后快速浸入蒸馏水中洗涤。一旦将聚L-赖氨酸浸入水中，它将立即从盖玻片上脱落，快速将盖玻片放回封口膜上，并使用Kimwipe去除盖玻片边缘周围的任何多余水分。盖住工作区，以防止可能粘附在Poly-L-Lysine涂层盖玻片上的碎屑。未使用的聚L-赖氨酸盖玻片可以在室温下储存以备将来使用。
  
  图2. Parafilm工作区
3. 通过以1,800rpm（203 x g ）离心1ml细胞培养物1.5分钟来选择健康细胞是必要的。弃去上清液并将细胞重悬于600μl新鲜TAP培养基中。慢慢地上下移动媒体几次然后让文化坐下来。健康的游泳细胞应在约10分钟后迁移至培养物的顶部。然后移取（从培养物顶部）200μl重悬浮细胞至聚-L-赖氨酸包被的盖玻片5分钟并遮挡样品避光。细胞被光线遮挡，因为它们会光照并向上游向光线，从而减少了粘附在盖玻片上的细胞数量。
细胞固定和透化
1. 5分钟后，将盖玻片上的液体倾斜，并用7.5mM HEPES pH 7.4中的200μl4％新鲜多聚甲醛（PFA）置换至疏水圈的中间。让细胞在室温下在固定剂中孵育15分钟。
  注意：如果存在非特异性叶绿体或明亮的pyrenoid信号（图3A和3B），则稀释PFA溶液。我们不用粉末制成PFA，但是通过简单地将未固化的16％PFA溶液的固定剂稀释至4％来改善标记。我们发现使用PFA 2-3周后，标记效率降低并使pyrenoid信号非常突出。从新鲜的安瓿中稀释固定剂缓解了这个问题。
  
  图3.使用非最佳条件进行鬼笔环肽染色。 A.如果细胞在染色液中孵育时间过长或PFA过期，细胞将显示强烈的pyrenoid信号（黄色箭头）和非特异性细胞质染色。这种类型的信号可以很容易地与Atto 488信号区分开，因为没有丝状核周或顶端染色，而是在整个细胞体中发现昏暗的模糊信号，如上面A和B所示。比例尺=5μm。 C. Chlamydomonas 细胞的一般图，突出显示粉红色的丝状肌动蛋白，蓝色的pyrenoid和绿色的叶绿体。
2. 将PFA溶液倾斜到Kimwipe中并将盖玻片放入含有1x PBS的Columbia瓶中洗涤3分钟。使用足够的PBS，使盖玻片完全浸没在液体中。＆nbsp;
3. 对于细胞透化，将盖玻片浸没在含有80％预冷丙酮（在水中稀释并在-20℃下储存）的哥伦比亚罐中，然后在-20℃下孵育5分钟。
4. 快速将盖玻片转移到含有100％预冷丙酮的第二个哥伦比亚罐中，并在-20℃下再孵育5分钟。
5. 将盖玻片放回封口膜上，如果需要，让它们风干至少2分钟或更长时间。
鬼笔环肽染色
1. 通过将盖玻片转移到含有1x PBS的Columbia瓶中并孵育5分钟来再水化细胞。
2. 将盖玻片放回封口膜上。用Atto 488鬼笔环肽（Sigma）在黑暗中染色盖玻片16分钟。这比推荐的染色时间短，可显着降低背景，提高信噪比。
  注意：与Alexa-488相比，Atto 488鬼笔环肽试剂大大提高了光稳定性和亮度，可以实现更均匀和可重复的细丝标记。由于光稳定性，Atto 488标记的幻灯片可以重新成像。
3. 通过将盖玻片转移到含有1x PBS的Columbia罐中，快速倾斜染色溶液并洗涤细胞。洗一次5分钟。
4. 用Kimwipe清除盖玻片上多余的液体，但要小心不要打扰疏水圈内部（细胞粘附的地方）。尽可能快地安装具有自密封Fluoromount-G TM （Invitrogen）的盖玻片。该密封剂设计用于染色实验，其中最终步骤是含水的。
图像采集
使用配备QiIMAGING QICAM的Nikon Eclipse Ti-S，在明场和宽场荧光通道（GFP滤光片组）中捕获0.3μm步进Z-堆叠。使用Huygens Essential deconvolution软件对ImageJ中的荧光图像进行去卷积。

数据分析

Hyugens Essential deconvolution软件（Scientific Volume Imaging）用于后图像分析。使用以下参数对图像进行去卷积：

算法：经典MLE
PSF
模式：理论
最大迭代次数：10
迭代模式：优化＆nbsp;
质量变化Thresh。（％）：0.001
信噪比：20
背景模式：自动
背景估计半径：0.7
相对背景：0.0
背景校正：如果可能
砖块模式：自动
每砖模式的PSF：自动
每砖的PSF，手动模式：1

食谱

1x PBS
1. 将1片PBS溶于80ml纯净水中，加入100ml，1x溶液。搅拌至溶解
2. 1片含有137 mM氯化钠，2.7 mM氯化钾和11.9 mM磷酸盐缓冲液
pH7.4的7.5mM HEPES缓冲液中的4％PFA
1. PFA水溶液16％（电子显微镜科学）
2. HEPES Stock Solution 10x（0.1 M，pH 7.4）（Farhat，2013）
  1. 对于100毫升0.1 M HEPES，pH 7.4，将2.38克HEPES加入适当的烧杯中（在这种情况下为100-200毫升）
  2. 向烧杯中加入80ml去离子水
  3. 在烧杯中加入搅拌棒，将其放在搅拌盘上直至完全溶解（约1分钟）
  4. 加入一个NaOH颗粒使pH值升至7.4。添加一个颗粒将使pH值达到7左右
  5. 一旦第一个沉淀完全溶解，如果需要，加入第二个NaOH颗粒，将pH升至7.4。仔细监测，如果在颗粒完全溶解之前pH值接近7.3 / 7.4，用干净的刮刀小心地取出NaOH颗粒
    注意：根据我们的经验，大约1.5颗颗粒适合将pH值提高到7.4，因此需要回收第二颗颗粒才能达到合适的pH值。
  6. 如果pH值过高，请小心加入少量HCl将其降至pH值7.4，同时监测pH值注意：戴上手套，保护眼睛，并使用这种酸性溶液时要格外小心。
  7. 一旦溶液的pH值为7.4，加入足量的去离子水使体积升至100毫升
  8. 如果可能的话，过滤（如果在这里使用Whatman滤纸），并在冰箱中储存长达4个月或等分并在-20°C下冷冻以备将来使用
  9. 对于50ml，将37.5ml的1x HEPES溶液加入到12.5ml新鲜的16％PFA中，最终浓度为7.5％HEPES缓冲液中的4％PFA。轻轻涡旋并在4°C下储存
鬼笔环肽原料制备
1. 按照制造商的说明，将冻干的鬼笔环肽试剂重悬于0.5 ml预冷甲醇中，并在-20°C下保存。避光
2. 为了制备工作原料，每个盖玻片加入5μl鬼笔环肽原液至200μl1xPBS。例如，如果您需要染色4个盖玻片，请将20μl的原液添加到800μl的1x PBS中。保持鬼笔环肽在任何时候都不受光照影响
TAP液体介质（1升）
1. 将约800毫升去离子水放入烧杯，烧瓶或瓶中
2. 添加以下解决方案：
  1. 10毫升100倍Tris缓冲液
    在最终体积100 ml H 2 O中溶解24.2 g tris（游离碱，不含tris HCl）
  2. 10毫升100倍TAP盐
    溶解18.75克NH 4 Cl，5克MgSO 4 ·7H 2 O（七水合物）和2.5克CaCl 2 ·2H 2 O（二水合物），终体积为500ml dH 2 O.
  3. 1毫升1,000倍磷酸盐溶液
    溶解21.6g K 2 HPO 4 和10.8g KH 2 PO 4 ，最终体积为200ml dH <子> 2 0
  4. 1毫升猎人微量元素
  5. 1毫升冰醋酸
3. 加入去离子水至总体积为1升
4. 测试溶液的pH值。它应该在7到7.3之间。如果需要，使用乙酸调节pH。如果最初pH值低于7，则从头开始重新开始
5. 高压灭菌，使用前冷却
1.5％TAP琼脂平板
1. 按照配方4a-d制备TAP液体培养基
2. 对于1.5％TAP平板，加入15 g Difco TM 琼脂，造粒至1 L TAP溶液
3. 加入搅拌棒和高压灭菌器
4. 从高压灭菌器中取出琼脂溶液，让溶液冷却。搅拌琼脂，使其均匀分布在整个容器中
5. 将30-40ml琼脂倒入每个培养皿中。 1升琼脂应制成~2个1.5％TAP琼脂平板的套管，可储存在4°C冰箱或室温下短期使用

致谢

感谢Avasthi实验室的成员进行故障排除和手稿反馈。这项工作是通过P20GM104936和P20GM103418（至P.A.）资助的。

利益争夺

我们没有利益冲突或竞争利益申报。

参考

Avasthi，P.，Onishi，M.，Karpiak，J.，Yamamoto，R.，Mackinder，L.，Jonikas，M.C.，Sale，W。S.，Shoichet，B.，Pringle，J。R. and Marshall，W.F。（2014）。肌动蛋白是 Chlamydomonas reinhardtii 的IFT监管所必需的。 Curr Biol 24（17）：2025-2032。
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Courtemanche，N.，Pollard，T。D.和Chen，Q。（2016）。在LifeAct与荧光蛋白融合的活细胞中计数聚合肌动蛋白时避免人工制品。 Nat Cell Biol 18（6）：676-683。
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Harper，J.D.，McCurdy，D.W.，Sanders，M.A.，Salisbury，J.L。和John，P.C。（1992）。莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）细胞周期中的肌动蛋白动力学。 Cell Motil Cytoskeleton 22（2）：117-126。
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