材料和试剂

材料
1. 1.5 ml Eppendorf ® DNA LoBind微量离心管（Eppendorf，目录号：0030108051）
2. 100 mm Corning ®组织培养处理的培养皿（Corning，目录号：430167）
3. 12孔Corning TM Costar TM 平底细胞培养板（Corning，目录号：3513）
4. 15毫升Falcon TM 锥形离心管（Corning，目录号：352096）
5. 6孔板
细胞系
1. ATCC ® BHK-21 [C13]细胞（ATCC，目录号：CCL-10 TM ）
2. Cop5细胞（Tyndall et al。，1981）
感兴趣的病毒
注意：从感染性克隆中准备感兴趣的病毒。建议病毒滴度应在105和107噬斑形成单位（PFU）/ ml之间制备。下面列出的病毒用于演示。这些病毒来源于感染性克隆，释放（第0代），在BHK-21细胞中传代并储存在-80°C。
1. RRV-T48
2. RRV-T48 A534V
病毒复制酶构建
注意：准备表达目的病毒的病毒复制酶（非结构蛋白）的构建体。下面列出的结构用于演示。如下面的构建图所示（图1），将编码RRV-T48复制酶，RRV-T48A534V和SFV4（用作阳性对照[Nikonov等，2013]）的区域克隆到pMC-gtGTU2载体中，其中含有巨细胞病毒早期启动子，来自单纯疱疹病毒（HSV）胸苷激酶的前导序列，带有插入的合成内含子和来自猿猴病毒40（SV40）的晚期多腺苷酸化信号。
1. RRV-T48
2. RRV-T48 <子> A534V
3. SFV
  
  图1.病毒复制酶构建图
试剂
1. Dulbecco的改良Eagle培养基（DMEM）（Sigma-Aldrich，目录号：D5030）
2. Iscove的改良Dulbecco's Medium（IMDM）（Sigma-Aldrich，目录号：51471C）
3. L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：G6392）
4. 胎牛血清（FBS）（Sigma-Aldrich，目录号：F6178）
5. 100x青霉素 - 链霉素（Sigma-Aldrich，目录号：P4333）
6. 胰蛋白胨磷酸盐肉汤溶液（TPB）（西格玛奥德里奇，目录号：T8159）
7. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：P5493）
8. 1 M HEPES缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：83264）
9. 0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液（Sigma-Aldrich，目录号：T4049）
10. RNeasy迷你套件（QIAGEN，目录号：74104）
11. TRIzol ®试剂（Invitrogen，目录号：15596026）
12. DNase I（罗氏，目录号：04716728001）
13. PolyATtract ® mRNA分离系统（Promega，目录号：Z5210）
14. Lipofectamine TM 2000试剂（赛默飞世尔科技，目录号：11668019）
15. VeriKine Mouse干扰素βELISA试剂盒（PBL Assay Science，目录号：42400-1）
16. pMC-gtGTU2载体（Nikonov et al。，2013）或任何哺乳动物表达载体（如来自Thermo Fisher Scientific的pcDNA或pCMV系列）

设备

-80°C冰箱
4°C冰箱
Vortexer（Bio-Rad）
移液器（Bio-Rad，目录号：166-0506,166-0507和166-0508）
CO 2 培养箱（Bio-Rad，目录号：4110）
生物安全2级（BSL-2）柜
高压灭菌器（Tuttnauer，ELV-D系列）
UVC5000紫外线交联剂（Hoefer，代号：UVC5000-230V）
Sunrise TM 吸光度酶标仪（Tecan）
Microfuge 16离心机（Beckman Coulter生命科学，目录号：A46473）

软件

Microsoft Excel或Prism 5

程序

显示病毒PAMP RNA分析方案的程序总结在图2中。

图2.病毒PAMP RNA分析的流程图

<强>

分析总病毒和经典病毒PAMP RNA
1. 从感染细胞制备总RNA样品。
  第-1天
  1. 将8×10 6个BHK-21细胞接种到100mm细胞培养皿上，并在含有10％FBS的DMEM中培养。将细胞保持在37℃，5％CO 2 过夜。
  < style =“color：＃666666; font-family：Arial，Helvetica，sans-serif; font-size：13.3333px; text-align：justify; white-space：normal;”>第0天
  1. 弃去BHK-21细胞生长培养基并用PBS洗涤细胞单层一次。用感兴趣的病毒感染细胞。作为示例，在无血清DMEM中分别稀释RRV-T48和RRV-T48 A534V 用于感染。通过感染复数（MOI）1.0的病毒感染BHK-21细胞单层，具有最小覆盖体积（对于6孔板中的每个孔，约400μl）。将细胞在37℃，5％CO 2下孵育1小时，然后将细胞维持在含有10％FBS的DMEM中另外6小时。＆nbsp;
  2. 根据制造商的方案，使用TRIzol试剂从受感染的BHK-21细胞中提取总RNA （Invitrogen TRIzol TM 试剂用户指南）。每1μg总RNA使用1U DNase I在37°C下处理提取的RNA 60分钟。
  3. 可选（具有非配对polyA尾的病毒）：隔离非经典PAMP。将100μg经处理的RNA等分到干净的Eppendorf®DNALoBind微量离心管（无RNase）中。根据制造商的协议（Promega）。
  4. 使用RNeasy Mini Kit根据制造商的方案（Qiagen）并在20μl无RNase的水中洗脱产物。
  5. UV在UVC5000紫外交联剂中以2000μJ/ cm 2使得到的样品中存在的感染性病毒RNA灭活5分钟。＆nbsp;
  6. 可选：如果需要，将RNA保存在-80°C更长时间。
2. 病毒PAMP RNA的分析
  第-1天
  1. 将1×10 6个 Cop5细胞接种到12孔板中，并在含有10％FBS和2mM L-谷氨酰胺的IMDM中培养。将细胞保持在37℃，5％CO 2 过夜。
  style =“font-size：10pt;”>第0天
  1. 使用Lipofectamine2000试剂将1μg经处理的总polyA（+）或polyA（ - ）RNA分别转染到12孔板中的Cop5细胞的汇合培养物中。简而言之，在100μl无血清IMDM中稀释3μlLipofectamine2000试剂，并在室温下孵育2-5分钟。在100μl无血清IMDM中稀释1μgRNA样品，并在室温下孵育2-5分钟。将100μl稀释的Lipofectamine2000试剂与100μl稀释的RNA样品混合，并在室温下孵育RNA-脂质混合物5至10分钟以形成RNA-脂质复合物。弃去BHK-21细胞生长培养基并用PBS洗涤细胞单层一次。向细胞中加入1ml无血清IMDM。将RNA-脂质复合物逐滴添加到培养基上，并在添加到混合物后轻轻摇动板。将转染的细胞在37℃，5％CO 2 下孵育24小时。
    第1天
  2. 将转染的Cop5细胞的上清液收集到1.5ml管中。在4℃下以3,000 x g 离心样品5分钟以除去细胞碎片。将上清液收集到新管中。
  3. 根据制造商的方案和标准曲线，使用VeriKine MouseIFNβELISA试剂盒测定转染的Cop5细胞产生的IFN-β的量。

分析非经典病毒PAMP RNA
第-1天
1. 将1×10 6个 Cop5细胞接种到12孔板中，并在含有10％FBS和2mM L-谷氨酰胺的IMDM中培养。将细胞保持在37℃，5％CO 2过夜。
第0天
1. 使用Lipofectamine2000试剂将1μg编码目的病毒复制酶的质粒转染到12孔板中的Cop5细胞的汇合培养物中。使用表达无活性复制酶的质粒（活性位点突变体）作为阴性对照。作为示例，将RRV-T48，RRV-T48 A534V 和SFV4复制酶构建体转染到Cop5细胞中用于以下分析。
2. 将转染的细胞在37°C和5％CO2下孵育48小时。＆nbsp;
第2天
1. 将转染的Cop5细胞的上清液收集到1.5ml管中。在4℃下以3,000 x g 离心样品5分钟以除去细胞碎片。将上清液收集到新管中。
2. 根据制造商的协议（pbl Assay science）以及标准曲线。对于每个独立实验，将用RRV复制酶表达质粒转染的细胞的上清液中测量的IFN-β水平标准化为由表达SFV复制酶的质粒转染的细胞产生的IFN-β的量。＆nbsp;

数据分析

在Microsoft Excel或Prism 5中收集IFN-β数量的数据。使用学生的双尾未配对 t -test分析数据。作为示例，IFN-βELISA测定的标准曲线计算在表1中.Cop5细胞在转染总病毒PAMP RNA（图3），非经典病毒PAMP RNA时产生的IFN-β水平（图4）将来自RRV-T48或RRV-T48 A534V 的复制酶构建体（图5）绘制在条形图中。相应的绘图原始数据在表S1，S2和S3。

表1.IFN-βELISA测定标准曲线简言之，根据下表制备7种浓度的小鼠IFN-β标准品。每孔加入100微升干扰素标准品，并在室温下孵育1小时。除去液体并用洗涤溶液洗涤三次。向每个孔中加入100微升稀释的抗体溶液，并在室温下温育1小时。除去孔中的内容物并用洗涤溶液洗涤三次。向孔中加入100微升稀释的HRP溶液，并在室温下温育1小时。除去孔中的内容物并用洗涤溶液洗涤三次。将100微升TMB底物溶液加入孔中，并在室温下避光孵育15分钟。向每个孔中加入100μl终止溶液以终止反应。在5分钟内测定450nm处的吸光度。

图3. Cop5细胞通过转染RRV-T48或RRV-T48 A534V 的总病毒PAMP RNA产生的IFN-β。用RRV感染BHK-21细胞-T48和RRV-T48 A534V 分别为MOI 1.0。裂解细胞并在感染后6小时分离总RNA。每克RNA样品1微克用于转染Cop5细胞。测定转染后24小时细胞上清液中IFN-β的量。表达IFN-β水平作为三次实验的平均值±SEM（*， P <0.05，使用学生的双尾未配对 t - 测试）。

图4. Cop5细胞通过转染来自RRV-T48或RRV-T48 A534V 的非经典病毒PAMP RNA产生的IFN-β。 BHK-21细胞被感染在MOI 1.0处分别使用RRV-T48和RRV-T48 A534V 。裂解细胞并在感染后6小时分离总RNA。通过去除poly（A）+ RNA（包括病毒dsRNA复制形式）从分离的RNA获得Poly（A） - 级分。将1μg每种RNA样品用于转染Cop5细胞。测定转染后24小时细胞上清液中IFN-β的量。

图5.通过转染RRV-T48或RRV-T48 A534V 的复制酶由Cop5细胞产生的IFN-β。用设计用于表达RRV-的质粒转染Cop5细胞。 T48，RRV-T48 A534V 或SFV4。在转染后48小时测定上清液中IFN-β的量。
将用RRV-T48或RRV-T48A534V复制酶表达质粒转染的细胞获得的值标准化为用表达SFV4复制酶的质粒转染的细胞获得的值（取为100）。归一化值显示为来自三次实验的平均值±SEM（*， P <0.05，使用学生的双尾未配对 t - 测试）。

致谢

该协议最初发表在Nikonov et al。，2013年的论文中。该研究得到了澳大利亚国家健康与医学研究委员会向SM（APP1031024）和爱沙尼亚研究理事会授予AM的资助。（IUT20-27）。 Suresh Mahalingam是NHMRC高级研究奖学金获得者（ID：APP11544347）。

利益争夺

所有作者都声明没有竞争利益。

参考

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