材料和试剂

LS柱（Miltenyi Biotec，目录号：130-042-401）
玻璃巴斯德吸管，高压灭菌（VWR，目录号：14672-200）
用于巴斯德吸管的吸气灯泡（CELLTREAT Scientific Products，目录号：229279）
50毫升锥形管（康宁，目录号：430290）
血清移液器（Costar）
1毫升微量移液管
96孔高粘板（Corning，目录号：3361）
移液器吸头
pNL-BaL-GFP重组HIV-1病毒
构建pNL-BaL-GFP HIV-1载体。 pNL4-3env（ - ）GFP编码全长NL4-3 HIV-1前病毒DNA，在env中具有移码并表达GFP代替nef，如前所述（He et al 。，1997）。通过从含有整个 env 编码区的CCR5-向性HIV-1株BaL中取代EcoRI-XhoI片段，从R9产生CCR5-向性HIV-1前病毒克隆R9BaL（ Gallay et al。，1995）。通过用来自R9BaL的pNL4-3env（ - ）GFP中的SalI-BamHI片段替换pNL-BaL-GFP来构建pNL-BaL-GFP。
抗体：
1. CD14，PE-Cy7（克隆：61D3）（Thermo Fisher，目录号：25-0149-42）
2. CD16，BV510（克隆：3G8）（BD BioSciences，目录号：563830）
3. SLAMF7，PE（克隆：162）（BioLegend，目录号：331806）
4. CCR5，非共轭（克隆：2D7）（BD BioSciences，目录号：555990）
活力染料：活/死紫（Thermo Fisher，目录号：L34964）
CD14微珠，人类（Miltenyi Biotec，目录号：130-050-201）
新鲜人体血沉棕大衣（美国德克萨斯州墨西哥湾沿岸地区血液中心）
Lympholyte-H（Cedarlane Labs，目录号：CL5020）
不含钙或镁的DPBS（Gibco，目录号：14190250）
RPMI 1640（Gibco，目录号：11875093）
ACK裂解缓冲液（Gibco，目录号：A1049201）
胎牛血清（FBS）（亚特兰大生物制品，目录号：S11550）
抗生素/抗真菌药（青霉素，链霉素，Fungizone）（PSF）（Gibco，目录号：15240062）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Millipore Sigma，目录号：E6758）
BSA（Millipore Sigma，目录号：A9056）
叠氮化钠（Millipore Sigma，目录号：S2002）
来自BD Fix / Perm试剂盒的固定缓冲液（BD Biosciences，目录号：554714）
选择的交联抗体（用于在HIV-1感染期间刺激单核细胞）
FACS解决方案（参见食谱）
MACS解决方案（参见食谱）
完整的RPMI解决方案（参见食谱）

设备

生物安全柜
枪吸管
QuadroMACS磁性细胞分离器（Miltenyi Biotec，目录号：130-090-976）
LSRII流式细胞仪（BD Biosciences）
带旋转铲斗转子的台式离心机
自动细胞计数器（伯爵夫人）（Invitrogen）

软件

FlowJo 10.5版（ https://www.flowjo.com ）＆nbsp;
GraphPad Prism V7（ https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/）

程序

在无菌条件下使用Lympholyte-H从新鲜的人血沉棕黄层中分离PBMC。
注意：在无菌生物安全柜中执行以下所有步骤。
1. 使Lympholyte-H平衡至室温。这对于确保外周血单核细胞（PBMC）的有效分离非常重要。＆nbsp;
2. 将约50 ml血沉棕黄层均匀分成四个50 ml锥形管（每管12.5 ml）。＆nbsp;
3. 向每个含有纯血沉棕黄层的试管中加入22.5ml DPBS，使体积达到35ml。（DPBS与血沉棕黄层的比例应大于1：1。）＆nbsp;
4. 剧烈（或涡旋）50ml锥形管10秒钟。这对于防止细胞聚集会很重要，这会影响隔离并导致红细胞污染。＆nbsp;
5. 在使用前剧烈摇晃淋巴液-H。＆nbsp;
6. 在生物安全柜中工作，关灯。
  注意：淋巴细胞-H对光敏感。
7. 将无菌玻璃巴斯德吸管放入含有血液/ DPBS混合物的50ml锥形管的底部。使用喷枪移液器将Lympholyte-H添加到玻璃牧场移液管中。最好使用10毫升条纹，将枪式吸管上的功率设置设置为“重力”。每50 ml锥形管应加入总共10 ml的Lympholyte-H。＆nbsp;
8. 淋巴细胞-H应立即开始在锥形管的底部形成一层，与血沉棕黄层明显分开（图1.h）。＆nbsp;
9. 每50毫升锥形管加入总共10毫升淋巴细胞-H。＆nbsp;
10. 每个50毫升锥形管重复上述步骤。每管的最终体积现在为45毫升。＆nbsp;
11. 在任何摆动式台式离心机中，以1,800 x g ，24°C，无间断，最大加速度和最小减速度旋转50 ml锥形管30分钟。＆nbsp;
12. 将橡胶吸球灯连接到新鲜的巴斯德吸管上。小心地从每个50毫升锥形管中取出中间淋巴细胞带（约5毫升）。该带将是混浊的，可能含有一些红细胞，并且位于颗粒状红细胞上方（在管底部）（图1.I）。＆nbsp;
13. 将这些细胞转移到新鲜的50毫升锥形管中。＆nbsp;
14. 对四个50毫升锥形管中的每一个重复此操作。＆nbsp;
15. 在每个含有纯淋巴细胞的新50 ml锥形管中加入DPBS至最终体积50 ml。＆nbsp;
16. 旋转管在1,500 x g ，24°C，完全断裂5分钟（“完全断裂”意味着中心断裂打开）。＆nbsp;
17. 丢弃上清液。＆nbsp;
18. 使用1ml微量移液管将每个沉淀重悬于2ml ACK裂解缓冲液中。确保颗粒完全重新悬浮。＆nbsp;
19. 将细胞在ACK裂解缓冲液中在室温下孵育6分钟。＆nbsp;
20. 顶部使用DPBS，将管旋转至900 x g ，24°C，完全断开5分钟。＆nbsp;
21. 丢弃上清液。＆nbsp;
22. 使用1 ml微量移液管将完全RPMI重新悬浮至37°C预热至37°C。确保细胞处于单细胞悬液中。每个血沉棕黄层加入总共10毫升培养基。在这个阶段，您可以组合来自4个独立分数的细胞（图1.v）。＆nbsp;
23. 按照制造商的说明准备1：100稀释的细胞到完整的RPMI中并依靠Countess（或您的首选方法）。
图1.过程（PBMC）隔离的第1部分中选定步骤的图形图。图标签对应于PBMC隔离过程中指示的步骤。
按照制造商推荐使用MACS缓冲液通过阳性选择（CD14微珠，Miltenyi Biotec）分离CD14 + 单核细胞。
注意：用抗CD14微珠孵育细胞25分钟，以提高分离的单核细胞的纯度。
在继续之前检查单核细胞的纯度。按照制造商的说明并如前所述（O'Connell et al。，2018）用CD14 PE-Cy7 mAb和活/死紫活力染料染色细胞（分离前和分离后）。在LSRII流式细胞仪（或其他流式细胞仪）上运行细胞并确定可存活的细胞CD14 + 的百分比（图2）。如果分离的单核细胞样品少于90％CD14 + ，则建议不要进行。单核细胞纯度是否应< 90％你可以将单核细胞返回到MACS缓冲区（如果你已经将它们重新悬浮在完整的RPMI中）并将它们传递给新的MACS LS柱，与第2步中完全相同。

图2.显示2个健康献血者之间单核细胞亚型的FACS图。健康对照B具有相当多的CD16 + 单核细胞。显示的细胞在单个细胞，骨髓细胞群（基于FSC和SSC），生存和表达CD14上进行门控。
将完整RPMI中的单核细胞重悬于96孔高结合细胞培养板中，每孔2×10 5个细胞/孔。＆nbsp;
如果需要激活单核细胞表面受体（例如，SLAMF7 [O'Connell 等。，2018]），用抗体对抗高抗性平板。预先在4℃下获得所需的受体24小时。在将DPBS中的交联抗体加入孔中进行交联之前，将其稀释。在添加细胞之前用DPBS洗涤孔3次并确保孔在任何时候都不会变干。＆nbsp;
作为阳性对照，如果使用R5-向性HIV-1病毒，每个适当的孔加入10μg/ ml的CCR5阻断mAb（2D7）。含有这种可溶性mAb的孔应在所有培养基更换时保留适当浓度的mAb。＆nbsp;
在37℃和4％CO 2 细胞培养24小时后，除去培养基并加入含有190pg / ml pNL-BaL-GFP的新鲜培养基。＆nbsp;
4小时后，用完全RPMI洗涤pNL-BaL-GFP感染细胞2次。＆nbsp;
将细胞重悬于200μl完全RPMI /孔中，并在37℃和4％CO 2 下培养。
每24-36小时，每个条件取出一份细胞（即。，一个孔），并用FACS洗涤。＆nbsp;
用CD14，CD16，活/死紫活力染料和任何其他抗体（即。，SLAMF7）染色细胞，如前所述（O'Connell et al 。， 2018）。
在室温下固定细胞20分钟，避光，每孔加入200μlBD固定缓冲液，彻底重悬细胞。＆nbsp;
用FACS洗涤细胞两次。＆nbsp;
分析LSRII（或类似的流式细胞仪）上的染色细胞以确定（％）CD14 + 活/死紫 - GFP + 细胞。 br /> 注意：应在24小时内对细胞进行分析，以确保GFP信号不会丢失。固定不会在短期内（小于24小时）影响GFP信号，但长时间固定会降低GFP。＆nbsp;
GFP + 细胞被认为是HIV-1 + ，因为使用该病毒的所有感染细胞都将表达GFP。添加CD14和活力标记确保分析的细胞是单核细胞（即，CD14 + ）和生存（即，活/死紫 - ）。

数据分析

使用FlowJo v10.5或更高版本（或根据您的偏好使用其他FACS分析软件）分析所有数据。＆nbsp;
应通过评估每种条件下（％）CD14 + 活/死紫 - GFP + 细胞进行分析。可以包括其他标记以包含其他标记。＆nbsp;
示例分析如图3所示。＆nbsp;
比较组间的感染性时，请根据需要使用学生的 t - 测试或单向ANOVA。

图3.示例FACS分析。 A.用于分析单核细胞感染性的代表性门控方案。 B.代表性的FACS图显示了来自上述CD14 + 门的阳性和阴性GFP单核细胞的实例。模拟条件是用pNL-BaL-GFP感染的单核细胞并且没有免疫细胞受体交联。注意HIV-1 + 单核细胞如何倾向于对SLAMF7受体呈阳性，并且通过交联激活SLAMF7受体可防止单核细胞感染。像这样的共表达分析可以用任何其他感兴趣的标记进行。 CL;交联。
数据可以显示为带连接线的XY图形（O'Connell 等，2018，图6d），也可以作为FACS点图，为您的结果提供额外支持（O'Connell < em> et al。，2018，图6d）。

笔记

该方案在我们的手中是可重复的，我们只注意到个体献血者之间感染程度的变化。＆nbsp;
每48小时在培养的单核细胞上刷新培养基。＆nbsp;
培养细胞最多7天。原代人单核细胞通常不会在分离后超过7天存活。＆nbsp;
单核细胞应显示HIV-1 + 细胞数量随时间的增加，直至约6-7天，此时感染性应随着单核细胞达到其终末离体寿命而趋于平稳。＆nbsp ;
单核细胞HIV-1感染的效率在受试者之间不同，并且取决于CD16 + 单核细胞的百分比。具有较高CD16 + 单核细胞水平的个体将显示更高百分比的HIV-1 + 单核细胞（图2和3）（Tuttle et al。，1998; Ellery et al。，2007）。

食谱

FACS解决方案
500毫升DPBS（1瓶）
1％（W / V）BSA
0.1％（W / V）叠氮化钠
MACS解决方案
500毫升DPBS（1瓶）
0.5％BSA
2 mM EDTA（用于CD14分离）
完整的RPMI解决方案
500毫升RPMI 1640
10％FBS
1％PSF

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院的支持，其形式是向YAA（1R21AI122808-01）提供R21。我们还要感谢Sarah Godbehere对本手稿的批评性评论。该方法改编自Wang 等人，，2018。

利益争夺

PO和YAA在调节用于治疗炎症的SLAMF7信号传导方面尚未申请专利。作者声明没有其他冲突。

参考

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Burdo，T。H.，Lackner，A。和Williams，K。C.（2013）。单核细胞/巨噬细胞及其在HIV神经病发生中的作用。 Immunol Rev 254（1）：102-13。
Cardoso，S。W.，Torres，T。S.，Santini-Oliveira，M.，Marins，L。M.，Veloso，V。G. and Grinsztejn，B。（2013）。艾滋病老龄化：实用评估。 Braz J Infect Dis 17（4）：464-479。
Ellery，PJ，Tippett，E.，Chiu，YL，Paukovics，G.，Cameron，PU，Solomon，A.，Lewin，SR，Gorry，PR，Jaworowski，A.，Greene，WC，Sonza，S。和Crowe ，SM（2007）。 CD16 + 单核细胞子集更容易感染并优先携带HIV -1 体内。 J Immunol 178（10）：6581-6589。
Gallay，P.，Swingler，S.，Aiken，C。和Trono，D。（1995）。非分裂细胞的HIV-1感染：病毒基质蛋白的C末端酪氨酸磷酸化是一个关键监管机构。 Cell 80（3）：379-388。
He，J.，Chen，Y.，Farzan，M.，Choe，H.，Ohagen，A.，Gartner，S.，Busciglio，J.，Yang，X.，Hofmann，W.，Newman，W。， Mackay，CR，Sodroski，J。和Gabuzda，D。（1997）。 CCR3和CCR5是小胶质细胞HIV-1感染的共同受体。自然 385（6617）：645-649。
Katlama，C.，Deeks，SG，Autran，B.，Martinez-Picado，J.，van Lunzen，J.，Rouzioux，C.，Miller，M.，Vella，S.，Schmitz，JE，Ahlers，J。，Richman，DD和Sekaly，RP（2013）。治愈艾滋病的障碍：靶向和根除HIV-1水库的新方法。 Lancet 381（9883）：2109-2117。
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O'Connell，P.，Pepelyayeva，Y.，Blake，MK，Hyslop，S.，Crawford，RB，Rizzo，MD，Pereira-Hicks，C.，Godbehere，S.，Dale，L.，Gulick，P。，Kaminski，NE，Amalfitano，A。和Aldhamen，YA（2019）。 SLAMF7是慢性HIV感染中IFN-α介导的CXCL10产生的关键负调节因子。 J Immunol 202（1）：228-238。
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