处理胎儿胸腺和隔离CD34 +细胞从胎儿肝

材料和试剂

胎儿胸腺/肝脏对从18 - 22周妊娠标本
Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Life Technologies，目录号：14190）
1x Iscove's Modified Dulbecco's Medium（IMDM）（Life Technologies，目录号：12440）
RPMI Medium 1640-L-谷氨酰胺（Life Technologies，目录号：11875）
第11号手术刀
胶原酶IV型（Life Technologies，Invitrogen ，目录号：17104-019）在PBS中以1:10稀释于ddH 2 O中的50,000 U/ml
透明质酸酶（240,000U/ml，1:10 PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：H6254）
DNase I（30,000U/ml，1:10 PBS）（Worthington，目录号：2006）
Pip/Tazo（Zosyn）-45mg/ml是100×储液
Ficoll-Paque PLUS（GE Healthcare，目录号：17-1440）
胎牛血清（FBS）（Omega Scientific，目录号：FB-12）
CD34 MicroBead试剂盒，人（Miltenyi Biotec，目录号：130-046-702/3）

设备

II类生物安全柜
37℃孵育器
振动器
离心机
100mm培养皿
100μm细胞过滤器
10ml注射器
16号钝端针
0.22μm过滤器
50ml锥形管
15ml锥形管
T25和T150烧瓶

程序

过程的概述如图1所示。
注意：在II级生物安全柜或无菌，HEPA过滤的环境中执行的所有步骤。

图1.
在15ml锥形管中洗涤胸腺：将培养基倒入烧杯中的漂白剂，使用解剖刀防止胸腺滑入漂白剂。用PBS将管填充至15ml。盖和倒转几次洗胸腺。将上清液倒入漂白液中。重复3-4次。
加入7ml RPMI + 10％FBS，并将所有东西倒入100mm培养皿中
用两个解剖刀将胸腺切成小（〜1mm）的片。如果你需要表型/基因型你的组织，如HLA类型*，删除一些媒体包含自由浮动的胸腺细胞在这一点进行分析。 * HLA分型可以通过流式细胞术以低分辨率进行（我们通常鉴定HLA-A * 02 +组织），并且用于高分辨率鉴定的基因分型（即 HLA-A * 0201）临床免疫遗传学实验室或通过基于PCR的分析试剂盒（Life Technologies，Invitrogen ，目录号：470214D）]。
将培养基和胸腺片吸入T25烧瓶中。补充介质与450微克/毫升的Pip/Tazo和轻轻摇动烧瓶来回混合。在37℃下培养过夜。该步骤对于防止植入小鼠的组织的细菌污染是重要的
在50 ml锥形管中洗涤肝脏：将培养基倒入烧杯中的漂白剂，使用手术刀防止肝脏滑入漂白剂。用PBS填充管。盖和倒转几次洗肝。将上清液倒入漂白液中。重复3-4次。
加入10 ml IMDM，并将所有东西倒入100 mm培养皿中。
使用两个解剖刀，将肝脏切成小块（〜3mm）。如果发现白色结缔组织，从其中刮掉红色肝脏组织，并将其丢弃在漂白剂中
均质化组织：将肝片和培养基吸入装有16号钝针的10ml注射器，并转移到50ml锥形管中。吸入注射器并再次排出以完全均匀组织
准备酶和Pip/Tazo：在新管中加入200μl每种胶原酶，透明质酸酶，DNase和Pip/Tazo到10ml IMDM。
将酶/培养基混合物倒入10ml注射器中，用0.22μm过滤器装配，并直接过滤到细胞悬浮液中。
盖住悬挂管，在外面用封口膜密封以防止泄漏。用机器在37℃下旋转或轻轻摇动90分钟。
将消化的细胞悬液通过一个100μm细胞过滤器移入新鲜的50ml管中
向悬浮液中加入PBS使体积达到50 ml。分成两个25毫升的管。
通过用在细胞悬液底部的10ml移液管非常缓慢地分配Ficoll，用每管10ml的Ficoll-Paque底下细胞。在无刹车的情况下，于21℃以950旋转20分钟。
界面应该厚。用5ml移液管取出，转移到另一个50ml管中。然后，在250ml管之间均等分开界面
你应该有两个接口管。用PBS将每种体积加至50 ml。在240℃下旋转10分钟，在240×g下旋转。小心吸出上清液。
当您用含有2％FBS的50ml PBS洗涤三次时，合并两个沉淀
将沉淀重悬在50ml RPMI + 10％FBS中。计数您的单元格。
任选：在T150烧瓶中培养细胞或以10×10 6 c/ml的浓度培养细胞1〜2小时，以使粘附的细胞粘附。补充培养基用450μg/ml Pip/Tazo。计数细胞孵育后。
根据制造商的方案，使用Miltenyi Biotec的CD34 MicroBead试剂盒（人）分选CD34 +细胞。计数单元格。在室温下在RPMI + 10％FBS中以1-10×10 6个/ml的浓度培养CD34 +细胞，直到准备好转导它们。
在补充有450μg/ml Pip/Tazo的RPMI + 10％FBS中，将CD34-级分在37℃下以10×10 6 cfu/ml的浓度培养过夜。

转导CD34 +细胞

材料和试剂

在PBS中的RetroNectin（Clontech，目录号：T100A/B）20μg/ml（等分并冷冻1mg/ml -20℃的原液）
Dulbecco's磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Life Technologies，目录号：14190）
FACS缓冲液（PBS中的4％FBS）
感染培养基 - 在Yseel的无血清T细胞培养基（Gemini，目录号：400-102）中的2％人血清白蛋白（美国红十字会，目录号：NDC 52769-451-05）（可选：补充50ng/ml人MGDF，SCF，和Flt3-配体）
细胞因子培养基 - 用10％FBS，补充有100ng/ml人IL-3，IL-6，SCF的RPMI。
慢病毒载体，滴定
细胞刮刀

设备

生物安全柜
37& C孵育器
离心机
6孔板，未处理（BD Biosciences，Falcon ，目录号：351146）

程序

计算6孔组织培养板所需的转导孔的数目（1孔可以处理不超过8×10 6个细胞）。用RetroNectin涂覆未处理的6孔板的所需数量的孔：将1.25ml的RetroNectin溶液（20μg/ml，在PBS中）分配到每个孔中，并且使覆盖的板在室温下在清洁生物安全柜
从孔中除去RetroNectin溶液
向每个孔中加入1.25ml FACS缓冲液进行封闭。让板在室温下放置30分钟。
取出FACS缓冲液，并用PBS洗孔一次
将PBS保留在涂层孔中，直到板准备使用。您可以在4℃保存。在即将接种细胞前从孔中取出PBS
对于转导效率对照，等分〜1×10 5个未转导的CD34 +细胞，并在96孔板中的200μl细胞因子培养基中在37℃下培养5-7天。
在RetroNectin包被的孔中（〜2×10 6个细胞/ml）在感染培养基中铺板剩余的CD34 +细胞，并在37℃下孵育1小时（参见下面步骤9中的替代方法） br />
将您的载体以2-10之间的感染复数（MOI）加入孔中。轻轻混合并在37℃下孵育过夜
替代方法（对于较低效率的载体）：首先向孔中加入感染培养基和载体，并在12℃下以3000×g离心90-120分钟，然后在12℃的培养基中添加细胞，轻轻旋转混合，在37℃下孵育过夜
第二天早上，收获细胞：轻轻刮擦孔底部，收集细胞，并计数
分装来自每种条件的〜1×10 5个细胞，并在96孔板中的200μl细胞因子培养基中在37℃下培养5-7天。 5-7天后，通过流式细胞术检查转导效率，例如，使用先前培养的未转导等分试样（参见步骤6）作为对照，观察记者。
对于将要移植的每只小鼠，将需要每个植入物0.5×10 6个转导的CD34 +细胞和用于注射的0.5×10 6个转导的CD34 +细胞。
对于植入的细胞，将每只小鼠的0.5×10 6个转导的CD34 +细胞与每个小鼠4.5×10 6个CD34 - 细胞组合，等分到无菌的1.5ml螺旋盖管中。旋转细胞沉淀它们，吸出上清液，再次旋转它们并吸出任何剩余的上清液，并将干燥的颗粒保持在冰上。
对于注射的细胞，每只小鼠自旋0.5×10 6个转导的CD34 +细胞以沉淀它们，吸出上清液，并将它们重悬于纯的RPMI中，每只小鼠150μl。将它们保持在冰上。

组织移植构建NSG-CTL小鼠

材料和试剂

胎儿胸腺块
CD34 +细胞用于植入和注射
NSG小鼠，至少6-8周龄
Matrigel，High Concentration（BD Biosciences，目录号：354248）
氯胺酮（Ketaject（Phoenix Pharmaceuticals，目录号：NDC 57319-542-02），100mg/ml）/甲苯噻嗪（Anaed注射液（Lloyd Laboratories，目录号：NADA 139-236），100mg/在PBS
中
异氟烷
betadine
无菌盐水
Carprofen（Rimadyl（Pfizer，目录号：NADA 141-199）），在无菌盐水中稀释1:100（在4℃下保持稀释长达24小时）
PBS

设备

流式细胞仪
15ml锥形管
无菌纱布垫
60mm皿
15 ml锥形管
正位移移液管（1-20μl）和提示
带有40号刀片的Oster剪刀
60 mm培养皿
异丙醇擦拭
16号癌症植入针与圆形尖端（套管和套管针）
手术工具：针尖钳，弯钳，剪刀，止血钳，高压钳施放器和伤口夹
Vicryl缝线，4-0（Owens& Minor，目录号：23000J304H）
胰岛素注射器
1 ml注射器

程序

手术前24小时，对小鼠使用2.7 Gy的剂量进行全身照射。
将胸腺片和培养基从烧瓶中倒入60mm皿中。将一些PBS倒入另一个盘子。
用PBS填充1ml注射器（无针）
冷却正位移移液管尖端通过将其放入开放的无菌管在冰中。与干燥的细胞团和Matrigel保持在冰上。重要的是保持Matrigel和任何管子或尖端，一直接触它冷，直到植入针装载。
麻醉小鼠：称量小鼠，并用15微升氯胺酮/赛拉嗪/克体重腹膜内注射。
当小鼠从氯胺酮/赛拉嗪变得缓慢时，将动物的鼻子放在15ml锥形管中，塞上浸有异氟烷的纱布，直到动物失去意识，其呼吸减慢到正常速率的约一半，并且不再响应爪爪。如果呼吸开始变得更快，在手术过程中保持该管手术以施用更多的异氟烷
打孔动物的耳朵编号或使用自己的首选识别方法
使用具有40号刀片的Oster剪刀，将每只小鼠的左侧从臀部到肩部刮在背部中心和腹部之间。
皮下注射0.3毫升稀释的Carprofen被动物的肩膀，然后将鼠标在无菌敷料的右侧，面向左边。
用PBS冲洗16号植入针的插管。
使用一对针尖镊子，将一块胸腺从盘中放入套管的开口，套管针正好在开口内，然后向后拉套管针以将组织吸入套管。
使用正位移移液管和冷却的尖端，将5微升冷基质胶放入一个管与干细胞沉淀，轻轻地搅拌足以使细胞悬浮。不要上下移动。当你慢慢拉回套管针以加载针头时，将基质胶/细胞悬液吸入套管的开口。在操作植入针时，使用移液器的助手更容易。
用Betadine擦拭鼠标的裸露皮肤，然后用异丙醇擦拭两次，擦拭该区域。
确定皮肤下最暗的点，其指示脾的位置。肾脏是距离脾脏约5 mm。
用弯曲的钳子提起皮肤，并在肾脏平行于脾脏的皮肤上做出约15mm长的切口。在下面的腹膜层做类似的切口
在雄性小鼠中，肾脏应该是可见的，并且可以通过按压在腹部上简单地挤出。你可以用止血钳支撑肾脏。
在雌性小鼠中，卵巢阻断肾脏。使用止血钳，拿起卵巢并拔出肾脏。
使用针尖镊子拔出肾小囊后端的一个小孔（1-2毫米）。
将植入针滑入这个孔并沿着肾脏，直到插管的开口被肾脏胶囊完全覆盖
轻轻挤出肾胶囊下的细胞和组织，然后将针头拉出。胸腺片可以是粘的，所以你可以使用弯曲的镊子，以确保胸腺片不会与针一起出来。
用钳子提起腹膜，轻轻使用止血钳将肾脏推回原位
用双结在腹膜内扎一针。
使用两个高压锅关闭皮肤。
混合保存用于注射的转导的CD34 +细胞，并吸入150μl（0.5×10 6个细胞）进入胰岛素注射器。通过眶后静脉注射将这些细胞注入小鼠
将一滴PBS放在每只眼睛上，将鼠标放回笼子里。
当所有的小鼠都被植入后，确认动物在离开前恢复意识
术后护理：手术后的第二天，向每只小鼠皮下注射0.3ml稀释的Carprofen和1.2ml无菌盐水。在手术后第2和3天，向每只小鼠皮下注射1.5ml无菌盐水。手术后监测小鼠和切口10天。取出高压灭菌器，10天后称重小鼠。
在8-10周后，通过使小鼠出血并对外周血进行FACS分析来检查移植，标记物例如CD45，CD3，CD4，CD8和载体应该表达的任何基因的染色。图2中提供了典型的流式细胞术图，即人CD3（T细胞标记）和转基因的HIV特异性TCR的染色。

图2. 外周血中的TCR +细胞样本

有关类似类型的移植程序的视觉参考，请参阅2012年可视化实验杂志中的Vatakis等人。
（ http： //www.jove.com/video/4181/using-blt-humanized-mouse-as-stem-cell-based-gene-therapy-tumor ）。

变异

转导的CD34 +细胞可以可行地冷冻而不是手术后注射。在这种情况下，不要在手术前照射小鼠。相反，等待4-6周，解冻细胞，照射小鼠（2.70Gy），并以0.5x10 6细胞/小鼠的轨道注射细胞。这些小鼠的术后护理在手术后第一天将为0.3ml卡洛芬。不需要注射盐水。

致谢

这项工作由来自NIH（编号R01AI078806（SGK），加利福尼亚艾滋病毒/艾滋病研究计划（CHRP）（编号163893）（SGK），UC Multicampus研究计划和来自加利福尼亚抗病毒药物发现中心编号MRPI-143226），以及由加州大学洛杉矶分校艾滋病研究中心（CFAR）资助（编号P30 AI28697）。

参考文献

Kitchen，S.G.，B.R.Levin，G.Bristol，V.Rezek，S.Kim，C.Aggilera-Sandoval，A.Balamurugan，O.O.Yang和J.A.Zack（2012）。体内抑制来自工程造血的抗原特异性T细胞的HIV干细胞。 PLoS Pathog 8（4）：e1002649。
Melkus，M.W.，J.D.Estes，A.Paddgett-Thomas，J.Gatlin，P.W.Denton，F.A.Othieno，A.K.Wege，A.T.Haase和J.V.Garcia（2006）。人性化小鼠对EBV和TSST-1具有特异性适应性和先天免疫反应。 em> Nat Med 12（11）：1316-1322。
Vatakis，D.N.，Bristol，G.C.，Kim，S.G.，Levin，B.，Liu，W.，Radu，C.G.，Kitchen，S.G.and Zack，J.A。（2012）。使用BLT人源化小鼠作为基于干细胞的基因治疗肿瘤模型 J Vis Exp （70）：e4181。