材料和试剂

移液器吸头
1. 1毫升尖头（Tarsons，目录号：521020）
2. 2-200μl（Tarsons，目录号：521010）
3. 0.2-10μl（Tarsons，目录号：521000）
1.5毫升微量离心管（Tarsons，目录号：500010）
15毫升聚丙烯离心管（Tarsons，目录号：546021）
50毫升聚丙烯离心管（Tarsons，目录号：546041）
0.1毫米直径的氧化锆/硅胶珠（Thomas Scientific，目录号：3411F09）＆nbsp;
2毫升聚丙烯珠粒打浆瓶（Bio Spec Products Inc.，目录号：10831）
PVDF膜（Bio-Rad，目录号：1620177或1620238）
Whatman滤纸1.5 MM（GE Healthcare，目录号：10426981）
0.45μm过滤器（Sartorius Minisart注射式过滤器，目录号：16555-K）
96孔微量测试板（Tarsons，目录号：941196）
具有用于重组蛋白过表达和纯化的亲和标签的表达载体（pProEx-Ht载体在N末端含有6x His标签，已用于过表达和纯化TcrX反应调节蛋白（Agrawal 等。，2015）以及KATms（乙酰转移酶）是来自IIS的Sandhya Visweswariah教授的礼物（Nambi et al。，2010）
表达菌株 E.大肠杆菌 BL21 Arctic Express TM [BF - omp T hsd S（r B - mB - ） dcm + Tet r gal λ（DE3） end A Hte [ cpn 10 cpn 60 Gent r ]（费雷尔） et al。，2003）（安捷伦科技，美国，目录号：230191）用于过表达KATms的TcrX和SP850cyc-菌株（Nambi et al。， 2010）
耻垢分枝杆菌 mc 2 155（ATCC，目录号：700084）＆nbsp;
pMV261载体（作为来自Dipankar Chatterji教授，IISc的礼物收到）
pMV261含有编码TcrX的基因（Singh et al。，2019）或您感兴趣的基因
pMV261含有编码TcrX K231R的基因（Singh et al。，2019）或您感兴趣的基因
Middlebrook 7H9培养基（BD Biosciences，目录号：271310）
甘油（Sisco Research Ltd.，目录号：62417）＆nbsp;
吐温80（西格玛奥德里奇，产品目录号：P4780）＆nbsp;
吐温20（西格玛奥德里奇，目录号：P9416）
Tyloxapol（Sigma-Aldrich，目录号：T8761）
卡那霉素（Goldbio，目录号：K-120）
油酸（Sigma-Aldrich，目录号：75090）
白蛋白（Amersco，目录号：0332）
葡萄糖（Sisco Research Ltd.，目录号：51758）
过氧化氢酶（Sigma-Aldrich，目录号：C9322）
考马斯亮蓝G-250（Sisco Research Ltd.，目录号：64222）
甲醇（Sisco Research Ltd.，目录号：96446）
磷酸（Alfa Aesar，目录号：A18067）
盐酸（HCl）（Fisher Scientific，目录号：A144SI-212）＆nbsp;
氯化钠（NaCl）（Merck Millipore Corporation，目录号：1064040500）＆nbsp;
氯化钾（KCl）（Merck Millipore Corporation，目录号：1049360500）＆nbsp;
磷酸氢二钠（Merck Millipore Corporation，目录号：1065860500）＆nbsp;
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ）（Merck Millipore Corporation，目录号：1048730250）＆nbsp;
Trizma基地（西格玛奥德里奇，目录号：T6066）＆nbsp;
2-巯基乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：M6250）＆nbsp;
苯基甲基磺酰氟（Sigma-Aldrich，目录号：P7626）＆nbsp;
盐酸苯甲脒（Sigma-Aldrich，目录号：B6506）
1％Nonidet-P40（Sigma-Aldrich，CAS：9016-45-9）
抗乙酰抗体（Cell Signaling Technology Inc.，目录号：9441，Dilution 1：7,500）
HRPO缀合的二抗（Cell Signaling Technology Inc.，目录号：7074，稀释1：5,000）
抗His抗体（Cell Signaling Technology Inc.，目录号：2365，Dilution 1：5,000）
抗TcrX多克隆抗体（稀释1：1,000）（在实验室中产生[Singh et al。，2019]）
Western Lightning PLUS ECL含有增强型鲁米诺试剂和氧化剂（PerkinElmer，目录号：NEL100001EA）
SDS（Affymetrix USB，目录号：18220）
EDTA（Sisco Research Ltd.，目录号：40648）
溴酚蓝（MERCK，目录号：1081220005）
cAMP（西格玛奥德里奇，目录号：A6885）
乙酰辅酶A（Sigma-Aldrich，目录号：A2056）
ADC溶液（白蛋白，葡萄糖，过氧化氢酶）（见食谱）
10x乙酰化缓冲液（见食谱）
cAMP，5 mM原液（参见食谱）（Sigma-Aldrich，目录号：A6885）
乙酰辅酶A，5 mM原液（参见食谱）（Sigma-Aldrich，目录号：A2056）
7H9-甘油 - 吐温80培养基（见食谱）
恢复媒体（见食谱）
磷酸盐缓冲盐水（见食谱）＆nbsp;
裂解缓冲液（见食谱）
5x Bradford Reagent（参见食谱）
存储缓冲区（参见食谱）
SDS-PAGE运行缓冲液（见食谱）
转移缓冲区（见食谱）
Tris缓冲盐水吐温20（TBS-T）（见食谱）
剥离缓冲液（参见食谱）
5x蛋白质样品缓冲液（见食谱）

设备

移液器
一个。 100-1,000μl移液器（Rainin pipet-lite，目录号：SL-1000）
湾20-200μl移液器（Rainin pipet-lite，目录号：SL-200）
C。 2-20μl移液器（Rainin pipet-lite，目录号：SL-20）
d。 0.1-2μl移液器（Rainin pipet-lite，目录号：SL-2）
2 mm电穿孔比色皿（Bio-Rad Laboratories，目录号：165-2086）
Mini-Protean凝胶电泳系统（Bio-Rad Laboratories，型号：165-8000）
Mini Trans-Blot细胞（Bio-Rad Laboratories，型号：Trans-Blot ® SD细胞）
Gel Doc成像系统（Bio-Rad Laboratories，型号：Universal Hood III）
37°C培养箱/振动筛（N-BIOTEK，型号：NB-205L）
冷冻离心机（Thermo Fisher Scientific，型号：Sorvall Legend X1R; Hettich Zentrifugen，型号：Rotina 420R）
分光光度计（Eppendorf，BioPhotometer ®，型号：D30）
Bead beater（Bio Spec Products，型号：Mini-Bead beater）
微量离心机（Tomy Kogyo Co. Ltd.，型号：Kitman-T24）
Vortexes（Shalom Instruments，型号：SLM-VM-3000）
加热块（加热至95°C）（Biobee Lab）
超低温冰箱（三洋，型号：MDF-U700VX）
Electroporator（Eppendorf Eporator，目录号：4309000019）
多模式酶标仪（Tecan，型号：Infinite M1000 PRO）
高压灭菌器
-80°C冰柜

软件

ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/download.html
来自BIO-RAD的图像实验室版本5.2.1软件（用于ChemiDoc TM 凝胶文档系统）

程序

体外乙酰化分析
通过蛋白质印迹分析使用抗乙酰基抗体探测蛋白质来评估TcrX蛋白质（作为代表）的乙酰化状态，其在该方案中以逐步方式讨论。响应调节因子TcrX（6x his标记）和突变TcrX（K231R）蛋白从 E过表达并纯化。如先前在Singh 等人中报道的，来自SP850cyc-菌株的大肠杆菌BL21 Arctic Express TM 和KATms（乙酰转移酶/ MSMEG_5458）（2019）。通过Bradford的蛋白质估计测定法（Stoscheck，1990; He，2011a）对纯化的蛋白质进行定量，并将蛋白质储存在储存缓冲液（-20℃;参见食谱）中直至使用。以下方案描述了蛋白质纯化后的实验程序。
设置体外乙酰化反应，然后进行抗乙酰基蛋白质印迹：
1. 以下列量混合以下成分：
  TcrX或TcrX K231R蛋白，3μg
  10x乙酰化缓冲液，2μl（见食谱）
  cAMP，0.4μl（参见库存浓度配方）
  乙酰辅酶A，0.4μl（见库存浓度配方）
  KATms，0.2μg
  将高压灭菌的MQ水加入20μl＆nbsp;
2. 在37°C孵育4小时（孵育持续时间可能因与乙酰化程度相关的底物蛋白质而异）。
3. 通过用5μl样品缓冲液稀释反应混合物来终止反应（参见配方）。将样品在95°C加热10分钟。
4. 使用15％SDS-PAGE（He，2011b）按照标准方案在100V下溶解样品3-4小时。
5. 使用Bio-Rad Mini Trans-Blot细胞通过电印迹将蛋白质转移至PVDF膜，按照制造商的方案在10 V下保持1小时。
  注意：
  1. 根据某人的SDS-PAGE凝胶尺寸切割PVDF膜并加载泳道或使用Bio-Rad的预切割预组装印迹膜/滤纸夹层。
  2. 在Bio-Rad的半干转移装置（Trans-Blot ® SD细胞）中，将蛋白质转移到PVDF膜上需要10 V，持续1 h，以获得特定的低分子蛋白质（~30 kDa）。应根据某人感兴趣的蛋白质（高或低分子量）对电压，电流，时间和设备类型（干/半干/湿）进行优化，以获得有效的转移。
6. 用1％TBST（30ml）中的5％BSA封闭PVDF膜90分钟，同时在室温下轻轻摇动。
7. 与1：7,500稀释的初级抗乙酰赖氨酸抗体孵育，在4°C温和摇动过夜。＆nbsp;
8. 用1x TBST（50ml）洗涤膜3次，每次10分钟，快速摇动。
9. 在室温下与1：5,000稀释的二抗孵育1小时，轻轻摇动。
10. 用1x TBST（60-70ml）再次洗涤膜3次，每次10分钟，快速摇动。
11. 根据制造商的方案使用增强的化学发光（ECL）开发印迹，并在Chemidoc凝胶文献系统中对印迹成像（图1）。
12. 在显影PVDF膜后，用1x TBST（50ml）洗涤膜3次，每次10分钟。
13. 将PVDF膜在55℃下与汽提缓冲液（30ml;参见配方）孵育25-30分钟（相应地优化）。
14. 倒出汽提缓冲液，用1x TBST（100 ml）冲洗PVDF膜6-7次，每次快速摇动10分钟，或完全除去β-巯基乙醇。
  注意：从PVDF膜检查β-巯基乙醇的典型气味，确保在用1x TBST缓冲液洗涤后已完全除去。重复洗涤直至完全脱落。
15. 用1％TBST（30ml）中的5％BSA在室温下封闭PVDF膜90分钟。
16. 重复步骤A7中的步骤（以1：5,000的稀释度使用抗his 6x抗体）直至步骤A10，以产生印迹并获得步骤A11（图1）中指定的图像。该步骤提供了加载的蛋白质量的参考图像。
  
  图1. 体外乙酰化评估。 RR蛋白TcrX和TcrXK231R与KATms（乙酰转移酶，来自 M. smegmatis 的MSMEG_5458酶）一起培养。协议。如Singh 等人报道的那样，在通过质谱法鉴定位点后产生乙酰化位点缺陷的TcrX蛋白（2019）。顶部，用抗乙酰赖氨酸抗体和底部抗His抗体探测印迹的图像。
TcrX蛋白的体内乙酰化分析
特定蛋白质乙酰化的体内评估需要它在分枝杆菌细胞中过表达。为此，典型的方法涉及在分枝杆菌穿梭载体中的强分枝杆菌启动子如 hsp60 或 msp12 下克隆和表达ORF。在分枝杆菌菌株如 M中引入质粒。耻垢分析然后分析过表达蛋白的表达或修饰状态。以下步骤描述了整个工作流程。
1. 制备电感受态耻垢分枝杆菌 mc 2 155
  使耻垢分枝杆菌 mc 2 155菌株具有电感受性，以引入携带目的基因的重组pMV261分枝杆菌质粒。＆nbsp;
  1. 通过在含有0.2％甘油，0.05％吐温-80和10％的5ml Middlebrook 7H9培养基中接种50μl耻垢分枝杆菌 mc 2 155原液制备1％原代培养物ADC。
  2. 将培养物在37℃下在摇床中以180rpm孵育直至OD 600 ~2（约2天）＆nbsp;
  3. 将1ml原代培养物接种到100ml补充有0.2％甘油，0.05％Tween-80和10％ADC的7H9肉汤中，并在37℃下在摇床中以180rpm生长直至OD 600 0.8-1.0（~24-32小时）。
  4. 将细胞在4,500 x g ，4℃下沉淀15分钟，然后在20ml高压灭菌的MilliQ水中洗涤3-4次。
  5. 然后用20ml无菌10％甘油洗涤3次。＆nbsp;
  6. 将细胞沉淀并重悬于2ml无菌10％甘油中。
  7. 在1.5ml离心管中制备各200μl的等分试样用于电穿孔。
  8. 使用预先冷却的100％乙醇将剩余的电感受态细胞等分试样放入1.5 ml离心管中，并将其储存在-80°C直至进一步使用。
    注意：在开始制备电感受态细胞之前，将装有100％乙醇的容器在-80°C保持6-8小时。当电感受态细胞等分试样准备好在微量离心管中时，然后将管浸入含有预冷乙醇的容器中，然后在-80℃下储存。
2. M中质粒DNA的电穿孔。耻垢分子 mc 2 155
  1. 向等份的电感受态细胞中加入1μg重组质粒并在冰上孵育2分钟。
  2. 在冰上预冷2mm电穿孔杯，将电感受态细胞和质粒混合物加入比色皿中并在冰上孵育10分钟。擦拭比色杯的外壁，用电穿孔仪以2,500 V脉冲，立即保持在冰上。
    注意：在电穿孔结束时，在电穿孔仪的显示上可以观察到约4-5毫秒的时间，这表明两个平行电极之间的电流正确并且有效的电穿孔。如果发生电弧放电，则显示时间以秒为单位，并且设定电压与电穿孔期间电池上施加的电压不同。这可能是由于缓冲液的高离子强度，高盐或细胞洗涤不足，最终导致无效或无电穿孔。＆nbsp;
  3. 将200μl回收培养基（参见食谱）添加到比色杯中，并将细胞转移到15ml锥形管中。添加更多培养基，使体积达到3 ml，在37°C，振荡器培养箱中以180 rpm的速度摇动试管4小时，以恢复细胞。
    注意：在电穿孔前准备好超过（20 ml）的恢复培养基（参见食谱）。＆nbsp;
  4. 在室温下以4,500 x g 收获细胞10分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于100μl回收培养基中。
  5. 在7H11培养基（琼脂基质）上的平板细胞补充有0.2％甘油，0.05％吐温80,10％含有适当抗生素的ADC（此处为25μg/ ml卡那霉素）。
  6. 将板在37℃孵育2天以获得转化体。
3. 裂解液制备和体内表达和乙酰化状态分析＆nbsp;
  1. 对于起子培养，将每个重组菌株的单个菌落接种于含有0.2％甘油，0.05％吐温80和10％ADC以及25μg/ ml卡那霉素的5ml 7H9培养基中，并在37℃，180rpm下培养。摇床2天。＆nbsp;
  2. 在50ml补充有0.2％甘油，0.05％泰洛沙泊和10％ADC以及25μg/ ml卡那霉素的7H9肉汤中继代培养0.5-1ml原代培养物，并在37℃下在摇床中以180rpm生长。 /> 注意：当需要大量的二次培养（例如，1/2升）时，主要是为了获得大量的蛋白质，原代培养也应该是更大的体积（10-50毫升）。＆nbsp;
  3. 一旦OD 600 达到~2-3（约2-3天），将细胞在4℃下以4,500 xg 沉淀，每次用10ml无菌洗涤3次PBS并在500μlTris裂解缓冲液（pH~7.5）中重悬沉淀。
  4. 将悬浮液转移到含有0.1 mm直径氧化锆/二氧化硅珠（~250μl体积缓冲液）的2 ml珠粒打浆小瓶中，并将珠子敲打30秒，在冰上间歇孵育8-10次（根据珠子的说明进行优化）均质器制造商）。
  5. 将裂解物在4℃下以10,000 x g离心10分钟并收集~400μl上清液。应注意避免收集未溶解的细胞和碎片。
  6. 通过Bradford的蛋白质估计测定法对裂解物进行定量。
  7. 按照标准方案，通过15％SDS-PAGE分离100μg蛋白质裂解物。
  8. 按照制造商的方案通过电印迹将解析的蛋白质转移到PVDF膜上，并如上面部分所述用抗乙酰赖氨酸抗体进行Western印迹，然后用蛋白质特异性抗体（这里是抗-TcrX）进行剥离和探测。
  9. 图2描绘了代表性开发的印迹，其报告了候选反应调节蛋白TcrX的过表达及其通过特异性抗体的乙酰化状态。当使用赖氨酸突变蛋白时，印迹也显示没有乙酰化，证实了体内乙酰化的位点。
    
    图2. 体内乙酰化分析。 M.耻垢分子 mc 2 在Middlebrook 7H9培养基（7H9）中培养155个单独携带载体pMV261或表达野生型TcrX或其突变蛋白的菌株。使用抗乙酰赖氨酸（上图）和抗TcrX（下图）抗体通过蛋白质印迹分析总共100μg的总蛋白质。 Arrow代表TcrX蛋白。

笔记

在准备 M时应该小心。耻垢分子细胞裂解物。涉及珠粒打浆的裂解步骤必须基于均化器进行优化，均化器的强度和打浆频率可能不同。＆nbsp;
应优化抗赖氨酸抗体的稀释，因为它可能在批次和批次之间变化。

食谱

ADC溶液（白蛋白葡萄糖过氧化氢酶）（100毫升）
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>白蛋白
5克
葡萄糖
2克
过氧化氢酶
3毫克将白蛋白，右旋糖和过氧化氢酶溶解在约50ml MilliQ水（~50ml）中，然后将体积补足至100ml。用0.45微米过滤器过滤灭菌。
10x乙酰化缓冲液（1 ml） class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>Tris（pH~7.4）
250 mM
NaCl
1,000 mM
cAMP，5 mM原液（1 ml）
将1.84mg粉末溶于~0.5ml MilliQ水中直至其完全溶解，然后将体积补足至1ml
乙酰CoA，5 mM原液（1 ml）
将4.046毫克乙酰辅酶A粉末溶于~0.5毫升MilliQ水中直至完全溶解，然后将体积补足至1毫升
7H9-甘油 - 吐温80培养基（90ml）
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>7H9粉末
0.47克
甘油（50％）
400μl
吐温80（20％）
250μl
1. 将0.47克7H9粉末溶于~50毫升MilliQ水中
2. 如上所述加入甘油和吐温80，用MilliQ水将总体积补足至90ml
3. 通过高压灭菌消毒并在室内储存
注意：由于甘油和吐温80是粘性的，因此将它们从100％的水中稀释至上述存量百分比，通过高压灭菌消毒并在室温下储存。＆nbsp;
回收介质（7H9-Glycerol-Tween 80-ADC）（20 ml） class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>7H9
17.87毫升
ADC
2毫升
甘油（50％）
80μl
吐温80（20％）
50μl
磷酸盐缓冲盐水（1,000毫升）
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>NaCl
8克
KCl
0.2克
Na 2 HPO 4
1.44克
KH 2 PO 4
0.24克
通过高压灭菌消毒并在室温下储存
裂解缓冲液（5毫升） class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>Tris-Cl（pH~7.4）
20 mM
NaCl
100 mM
甘油
10％
PMSF
1 mM
苯扎米啶盐酸盐
1 mM
5x Bradford Reagent（100 ml）
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>考马斯亮蓝G-250
50毫克
甲醇（100％）
23.5毫升
磷酸（85％）
50毫升
加入MilliQ水，使体积达到100毫升
储存缓冲液（500毫升） class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>Tris-HCl，pH 8.0
50 mM
甘油
50％
NaCl
50 mM
DTT
1 mM
SDS-PAGE运行缓冲液（1,000 ml）
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>Tris
3克
甘氨酸
14.4克
SDS
1克
通过添加MilliQ水来弥补体积
注意：SDS-PAGE运行缓冲液的pH值为~8.2-8.5。
转移缓冲液（1升）
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>Tris
3克
甘氨酸
14.4克
甲醇
200毫升
通过添加MilliQ水将体积补足至1L
注意：转移缓冲液的pH值也应为8.2-8.5。
Tris缓冲盐水吐温20（TBS-T）（1,000 ml） class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>Tris（pH~7.5）
10 mM
NaCl
153.8 mM
吐温20
0.1％
剥离缓冲液（20 ml） class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>Tris-Cl（pH 6.8）
62.5 mM
SDS
2％
β-巯基乙醇
0.7％（140μl/ 20 ml）
5x蛋白质样品缓冲液（10 ml）
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：300px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>Tris（pH-6.8）
0.25 M
甘油
40％（4毫升/ 10毫升）
SDS
10％
溴酚蓝
0.25％
β-巯基乙醇
5％（0.5毫升/ 10毫升）

致谢

这项工作得到了印度生物技术部的支持（Grant No. BT / PR17357 / MED / 29/1019/2016）。该研究还得到了印度科学院DBT合作项目（DBT / BF / PRIns / 2011-12）和Infosys基金会的部分支持; DST-基础科学和技术基础设施项目的设备支持（SR / FST / LSII-036/2016）。

利益争夺

作者宣称没有竞争利益。

参考

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Ferrer，M.，Chernikova，T。N.，Yakimov，M。M.，Golyshin，P。N.和Timmis，K。N.（2003）。伴侣蛋白在低温下控制大肠杆菌的生长。 Nat Biotechnol 21（11）：1266-1267。
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