材料和试剂

白色念珠菌文化
Tris-SO
DTT
山梨醇
裂解酶（Sigma-Aldrich，目录号：L2524）
K ⁺ MES [2-（N-吗啉代）乙磺酸钾]
K] + HEPES [4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸钾]
PMSF
Tris-DTT缓冲液（见配方）
山梨醇缓冲液（见配方）
KH sub 2 PO 4 4& K ₂ HPO ₄（请参阅配方）
断裂缓冲液（BB）6.0（参见配方）

设备

带温度控制的培养箱摇床
离心机
Dounce（浓杜松40毫升）（Wheaton，目录号：06-435C）

程序

文化准备
用足够的起始培养物接种以产生具有OD 600 = 1.0-2.0（OD 600至多7）的白色念珠菌细胞的培养物已经在我们手中）在第二天早上所需的开始时间。在200rpm下在30℃摇动过夜。
方法
1. 通过以4000转/分钟/em/10分钟/RT（室温）旋转收集细胞。
2. 倒掉介质
3. 重悬细胞在称重的离心管中的dH 2 O中。
4. 以2500转/g/5分钟/RT旋转。重新获得大量的细胞。
5. 重悬细胞在Tris-DTT缓冲液（见配方）〜5毫升每克细胞
6. 在30℃温和振荡（〜100rpm）孵育15分钟。
7. 以2500转/g/5分钟/RT旋转。
8. 在约5ml/g细胞预热的1.2M山梨醇缓冲液中重悬沉淀。
9. 旋转2,500英寸x g /5分钟/RT
10. 称取0.2mg/g裂解酶细胞。溶解于每克细胞2ml预热（30℃）1.2M山梨醇缓冲液中。在此溶液中重悬沉淀。
11. 孵育细胞裂解酶溶液约60分钟/30℃，轻轻摇动（〜100 rpm）或直到原生质体形成（通过渗透休克检查原生质球形成：添加30微升细胞到2毫升1.2 M山梨醇和水涡旋水样品应清除）。
12. 旋转2,500分钟/g/5分钟/RT。弃去上清液。
13. 重悬于冷的1.2M山梨醇缓冲液〜5ml/g细胞。旋转2,500×g/5/5分钟/4℃。
14. 在最少量的冷断裂缓冲液（BB）6.0中重悬，然后在含有1mM PMSF终浓度（〜4ml/g细胞）的BB6.0中补充。
15. 使用紧密的dounce匀浆15次。 Dounce应该〜3/4满或少一点。上升行程必须快速稳定。气泡可以打破线粒体，所以尽量不要让它弹出
16. 旋转匀浆5分钟/4℃/3,000×g /天。将上清液保存在新管中并保持在冰上（上清液应该是混浊的）。
17. （用于更高产率的任选步骤）用PMSF和紧密的dounce并如上所述旋转在BB 6.0中再次悬浮颗粒。合并上清液。丢弃颗粒。
18. 旋转混合的上清液5分钟/4℃/3,000×g。保存上清液（如果仍然得到大的沉淀，则重复该旋转步骤以清除更多的污染膜）。
19. 旋转上清液10分钟/4℃/12,000xg。
20. 倒出上清液并将沉淀重悬于少量BB 7.4（如果线粒体用于体外进口测定，则用牛血清白蛋白）。
21. 然后旋转10分钟/4℃/12,000×g 然后除去任何围绕红棕色线粒体沉淀的白色膜，然后用少量的BB 7.4与BSA重悬浮。
22. 如果仍存在污染膜，请重复上述步骤
23. 估计线粒体浓度如下：添加10微升粗线粒体到990微升0.6％SDS。作为空白添加10μlBB 7.4与BSA至990μl0.6％SDS。使用Quartz比色杯测量A <280>。 0.21的吸光度值对应于未稀释的混合物中的10mg/ml蛋白质。
24. 等分适量，在干冰/液氮中快速冷冻

食谱

Tris-DTT
0.1M Tris-SO 4（pH 9.4）
10mM DTT（在即将使用前从冷冻的1M DTT等分试样中制成新鲜）
1.2 M山梨醇缓冲液
1.2M山梨醇 20mM KPi（pH7.4）
断开缓冲区，BB（6.0）
0.6M山梨醇 20mM K on + MES（pH 6.0）（在使用前加入PMSF至1mM终浓度）
PMSF
34mg/ml（0.2M）的乙醇溶液
断开缓冲区，BB（7.4）
0.6M山梨醇 20mM K on + HEPES（pH 7.4）（用KOH调节pH）
2.4M山梨醇原液（去离子水溶液）
1 M K ⁺ MES原液（pH 6.0）
过滤灭菌，并在室温下保存在金属箔
1 M KPi（pH 7.4）
由1M KH sub 2 PO 4和1 MK 2 sub HPO 4的储备物制备并混合，直至 pH = 7.4。不要用HCl或NaOH滴定。

致谢

该方案改编自：Hewitt等人（2012）。在Traven实验室和Lithgow实验室在白色假丝酵母（Candida albicans）线粒体上的工作由澳大利亚国家卫生和医学研究委员会（APP1023973）的项目资助支持。 V.H.是澳大利亚研究生奖的获得者。

参考文献

Daum，G.，P.C.Bohni，et al。（1982）。将蛋白质导入线粒体。细胞色素b2和细胞色素c过氧化物酶位于酵母线粒体的膜间隙中。 J Biol Chem 257（21）：13028-13033。
Hewitt，VL，Heinz，E.，Shingu-Vazquez，M.，Qu，Y.，Jelicic，B.，Lo，TL，Beilharz，TH，Dumsday，G.，Gabriel，K.，Traven，A.and Lithgow ，T.（2012）。线粒体生物发生的模型系统揭示了蛋白质输入和膜组装途径的进化重新布线。 Proc Natl Acad Sci U S A 109（49）：E3358-3366。
Hewitt，V.，Lithgow，T。和Traven，A。（2013）。白色念珠菌线粒体蛋白输入测定。生物协议 3（4）：e331。