材料和试剂

小鼠＆nbsp;
成年（12周龄或更大）雄性小鼠（C57BL / 6J）（Charles River，L'Arbresle，France，Strain Code 027），在实验开始时重22-28g。小鼠单独饲养，每只年轻成年小鼠（＆> 12周）用于避免偏倚，因为偏差是由于在受控温度（约23℃）的环境和12-12小时光 - 暗循环下的湿度和可自由获取食物。增加发育增长曲线的体重。
注意：选择C57BL / 6J小鼠是因为它广泛用作饮食诱导肥胖的模型，因为它易于发展严重程度，肥胖，葡萄糖耐量和中度胰岛素抵抗。试验开始时的体重只是一个指标（C57BL / 6J平均体重12周）值得注意的是，如果使用不同的菌株，动物的初始重量可能会有所不同。
饮食
在饮食诱导的肥胖方案中，可以分配动物以获得巧克力混合物（CM）的自由进入或高脂肪饮食（HF）的独家进入以用于肥胖发展的研究，如图1A所示。 CM实验称为条件1，HF实验称为条件2.

图1.主要实验程序的示意图。 A.两个不同的经历，每个都有一个单独的对照组，即条件1和条件2.对照组在条件1和2接受标准食物随意。在习惯期后，在条件1中，病例组在标准食物饮食和巧克力混合饮食（CM）之间提供自由选择，而在样本大小显示在括号中，表示每组中的小鼠数量B.在条件1中限制进入能量密度食物测试的时间线（上述条件2病例组仅优选高脂肪（HF）高碱性食物。 C）给予超重小鼠CM（条件1）或HF（条件2）在光 - 暗循环的光（静止）阶段期间连续3天小时一小时以测量喂食不灵活性。用于评估计算机摄入量的设置的表示小鼠将获取食物的时间限制在2小时。并且5只对照小鼠接受标准食物，而条件1的病例小鼠给予标准食物/巧克力混合物，条件2的病例小鼠给予高脂肪饮食。在第2,4和6天，所有动物仅接受标准食物。 br />
1. 标准食物（SDS，Witham，UK，目录号：801151）
  标准食物含有10.76 MJ kg -1 -1的可消化能量（17.5％来自蛋白质，75％来自碳水化合物，7.4％来自脂肪;表1）。通常，标准食物碳水化合物由45％淀粉贡献和大约4％的单糖（单糖加加合物）占总碳水化合物重量的比例。＆nbsp;
2. 商业巧克力（CM）混合物的颗粒
  CM由等量的Bounty ®，Snickers ®，Mars ®和Milka ®巧克力（当地超市）制成CM。颗粒含有20.6MJ kg -1的可消化能量（17％来自蛋白质，52％来自碳水化合物，24％来自脂肪;碳水化合物来自8％淀粉和约44％单糖）（单糖加加合物，表1）。
3. 高脂肪（HF）饮食（试验饮食> ，目录号：58Y1）
  HF颗粒含有22 MJ kg -1 可消化能量（24％来自蛋白质，30％来自碳水化合物，35％来自脂肪;碳水化合物由5.4％的淀粉和约6.4％的单糖（单糖加二糖，表1）贡献。
注意：
1. 上面列出的饮食描述了使用所提供的方案成功使用的饮食;但是，使用具有相似成分的替代饮食也可以成功。
2. 我们一直在实验中观察了多年的实验经验，持续约3至4天，以确保维持感官特性。在高能量自由选择的肥胖饮食中，15％的小鼠不会获益 - 抗性）。＆nbsp;
表1.实验饮食的营养成分和能量含量。 SC和HF饮食的成分由制造商提供.CM是在实验室制备的，其成分由Alquimisa laboratories SL进行分析。（西班牙萨拉曼卡）。
奎宁盐酸盐脱水（Sigma-Aldrich，Madrid，Spain，目录号：Q1125）用于食品掺假，以测试喂养不灵活的小鼠。

设备

用于巧克力混合物的研磨机和勺子（Bounty ®，Snickers ®，Mars ®和Milka ®）颗粒制备
饮食储存冰箱
使用RS232 / USB端口进行数据记录的个人计算机
PheCOMP系统（Multitake型号，Panlab，巴塞罗那，西班牙，目录号：LE0851B）
Allentown Caging Equipment，ACE，197重量x 306深度x 212高度mm，参见Bura et al。，2010），提供网格地板和支撑每个笼子的平台包含2个红外框架（16 x 16光束，间隔16 mm），可同时记录水平活动和饲养（Panlab LE8827饲养红外框架）。
注意：
1. 参见C.笼子包含2个喂食器单元和2个饮水单元，并给出每秒0.02克的进气数据分辨率，与标准笼子相比，允许更高的食物量（g）或液体消耗量（ml）;多个分配器组合的模块化结构使它们适用于我们的自由选择实验。乳头饮用的水量和任何可能的滴水也可以使用相同的传感器系统，精度为20μl。
2. 一个笼子只能用于一只鼠标。
3. 为此，制造商（Panlab，巴塞罗那，西班牙）提供20克精确重量，用于饮料和喂料器的口径。在每次实验之前，校准笼子的重量传感器系统。 >
图2.研究期间使用的住房的代表性图像。 A.用于鼠标住房的标准个性化笼子B.BheCOMP笼子（西班牙Panlab），用于自动记录食物/水的设备个体化小鼠的摄入量和活动量。

软件

Compulse软件（Panlab，Barcelona，Spain）用于自动数据收集
GraphPad PRISM 6.0软件（GraphPad Software.Inc。，San Diego，CA，USA），用于绘图的软件
SPSS 17.0（SPSS Inc，Chicago，IL，USA）统计分析软件
“Mtb2int.pl”和“int2combo.pl”用于处理Phecomp cages的Perl脚本将文件输出到间隔逗号分隔值（CSV）文件。这些脚本可在github上找到： https://github.com/cbcrg/phecomp/blob/master/lib/perl/
Pergola（Espinosa-Carrasco et al。，2018b）（ https://github.com/ cbcrg / pergola ）：Pergola是一个Python库和命令行工具，用于将纵向行为数据转换为基因组文件格式，用于分析和可视化
综合基因组学观察者（IGV）（Robinson et al。，2011），（ http ：//software.broadinstitute.org/software/igv/ ），用于基因组数据可视化的桌面应用程序
Pergola网络服务器（Espinosa-Carrasco，2019）（ http://pergola.crg.eu/ ），一个用户友好的Web界面，使用Pergola处理和可视化纵向行为数据

程序

实验装置
1. Phecomp保持架应放置在稳定的机架上，以避免食品/液体传感器可检测到的振动，并导致不精确的寄存器。
2. 含有巧克力混合物的食物，含有巧克力混合物的食物，含有巧克力混合物的食物，含有巧克力混合物的食物，含有含有巧克力混合物的食物的食物，含有含有含有巧克力混合物的食物的巧克力的食物的食物
3. 巧克力混合饮食准备：为了制备CM，分成等量的Bounty ®，Mars ®，Snickers ®和在微波炉中加热混合物，在350 W下加热2分钟，得到均匀的糊状物，将混合物在光滑的表面上熔化，然后作为Milka ®巧克力，在碗中混合。将得到的片剂保持在冰箱中至少24小时。一旦固结，将得到的片剂切成小而相等的小丸，得到结果。。
注意：由于食物的感官特性对快感值有影响，混合物中混合物的均匀性是片剂的延伸至关重要。在同一行中，我们建议将其储存在冰箱中直至给予动物。我们建议每周至少更换两次巧克力。
适应隔离（适应阶段）
家养小鼠（C57B1 / 6J 12周龄雄性）个体化进入Phecomp笼（适应期），在开始饮食诱导的肥胖方案之前至少10天提供标准食物和水随意至少10天基线膳食模式和运动活动。
注意：态度相关行为变化的时间过程和动态特征的表征需要隔离。该协议可用于两性，但女性对压力的反应比男性更大（Senst et al。，2016）。
肥胖发展阶段
1. 对于每种情况，使用同窝仔作为称重小鼠并随机分配（使用Excel RAND（）功能）到不同的饮食条件对照动物（仅给予标准食物）。
2. 在3或4天期间不间断地记录动物。在这些期间，系统用于服用大约每小时饲料对照组，其中标准食物和实验小鼠在巧克力和SC之间自由选择或仅用高脂肪饮食8周。，用于精炼喂料器和清洁笼子。
注意：＆nbsp;
1. 所有饮食均随意提供。在态度发展阶段结束时，体重增加必须是显着的CM小鼠的体重增加10％，参见Espinosa-Carrasco et al。，2018a）。每周称重两次。整个阶段获得食物消耗，水摄入量和活动的昼夜记录通过使用自动收集系统（Phecomp cages和Compulse软件，参见设备和软件部分，相当可观）。
2. 更长的录音（6天）将更加了解更“自然”的动物行为，但需要更短的录音来跟踪笼内产生的所有可能的问题（例如，涂抹机上的肮脏积累在那里，我们认为3-4天的记录是最合适的选择。信号转换和/或锯末的红外光束破坏）。
体重和喂养行为分析
1. 在整个实验期间，每周两次注册体重，始终在一天的同一时间。＆nbsp;
2. 通过从随后几天的体重减去CM或HF暴露的第1天的体重来确定体重。
测试阶段
在对象开发阶段结束时，评估饮食诱导的非适应性行为的外观，例如适应性行为或行为不灵活性。

评估饮食诱导的肥胖小鼠的强迫摄入
1. 24小时内食物的衍生动物（水仍然随意提供）和食物返回时的记录喂养行为（对照小鼠的标准食物，巧克力混合物和食物或高脂肪饮食的小鼠和 2 ，值得尊重）。二十四小时的食物限制是一种强有力的膳食，对其整体或长期健康影响相对较小（Toth和Gardiner，2000）与自由喂养条件相比，再喂食后能量摄入量（KJ）的增加提供了有关饥饿对寻求食物和摄取食物的影响的信息。＆nbsp;
2. 在第1,3和5天，可用食物是标准食物（用于对照），在黑暗阶段开始时每天2小时（20：30-22：30小时）连续6天。标准食物和巧克力混合物（条件1 中的病例小鼠）或高脂肪饮食（条件2 中的病例小鼠）。第2,4和6天仅提供标准食物仍然随意提供水。一天剩下的时间（饥饿22小时）没有提供食物，参见图1B。这种食物限制时间表可以保持小鼠的动力它已被证明是非优选的和他们喜欢的饮食。它已被证明是安全的，老鼠确实恢复体重（Tucci et al。，2006）。
  注意：在为期6天的测试阶段后，两种情况下的动物都可以获得免费食物，以恢复其正常体重和摄食行为。对于一些小鼠，通常会在笼子内找到HF小片的碎片。出于这个原因，我们建议使用Phecomp记录修正溢出物（例如，减去内部未食用的食物量）笼子）。否则，我们不能假设整个食物摄入量与食用的真正食物相对应。
评估不灵活的食物摄取
1. 限制使用能量密集的食物
  标准食物和水。在明暗周期的光照（静止）阶段，每天限制进入CM或HF颗粒至1小时仍提供 ad libitum ，见图1C。
  该测试评估（i）不灵活的行为，灵活的消费者预计将恢复标准食物摄入量，而不灵活的消费者将拒绝标准食物并继续等待其（ii）全面摄入类似暴食的食物，其特点是在重新喂食过程中会迅速食用大量的CM或HF。
2. 食品掺假与盐酸奎宁
  暴露的小鼠在条件1或条件2掺假（CM或HF）饮食和标准饮食期间24小时食物随意访问。对于盐酸奎宁食品掺假，每千克添加3克盐酸奎宁的搅拌混合物，确保混合物中奎宁的浓度均匀。
  注意事项：由于苦味可能损害CM / HF的享乐特征，该测试的基本原理是，以确定僵化消费者强迫进气的创建此冲突，柔性小鼠（自控制的）改变的指示符其消耗未掺杂非优选食品，同时不灵活的消费者不此苦味作出反应，并继续采取这种食物。选择是实验确定的奎宁的浓度是在C57BL / 6J小鼠厌恶。对照小鼠被给予标准饲料和之间的选择在每次测试之前和之后测量所有大米的重量，食物消耗和水摄入量。＆nbsp;
注意：在限制进入3天试验后，动物在自由饮食条件下保持正常饮食，以恢复其正常体重和进食行为。

数据分析

膳食模式分析
在本节中，我们总结了视觉识别高热量饮食对昼夜节律喂养节律性的影响所需的所有步骤。我们在实验期间以1秒的分辨率记录了单个小鼠固体和液体摄入9周。
注意：来自每个重量传感器和红外线框架的连续信号被放大，数字化并用于数据采集和存储的计算机软件。
＆nbsp;＆nbsp;在采集过程中，使用COMPULSE软件（Panlab，Barcelona，Spain）进行膳食模式分析。膳食模式分析包括记录持续时间和饮食行为的复发间隔，以计算活动喂食/饮酒行为被认为属于
当与下一次喂食/饮酒行为和存在分开不到120秒时，同一餐或饮酒回合被合并为单一的食物/水发作（参见Heyne et al。，2009）。
＆nbsp;＆nbsp; COMPULSE软件计算的喂养参数及其生物学意义列于表2中。
＆nbsp;＆nbsp;为了量化运动活动，我们使用了ActiTrack软件（Panlab，西班牙）。
＆nbsp;＆nbsp;对于膳食模式数据的统计分析，我们使用线性混合模型并将饮食作为固定效果包括在内。'鼠标ID'作为随机效应包括在内，因为我们在免费的情况下处理了重复测量在随后的 P <0.05>后， P <0.05>认为差异被认为是显着的。为了量化昼夜节律喂养节律性损失，我们使用三向重复测量方差分析（因子，饮食和阶段）。为了分析测试阶段的能量摄入，我们使用双向ANOVA和饮食（SC，SC + CM，SC + HF）作为受试者之间的因素。 em> P <0.05。统计分析可以使用社会科学统计软件包SPSS ®进行。

表2.定义膳食模式及其行为意义的参数

纵向分析
Pergola; http://cbcrg.github.io/pergola ）专为（高通量）纵向行为数据的操作，建模，可视化和集成而设计。简而言之，pergola将纵向信息格式化为带有pergola的文件后的文件（步骤1和2），并使用Pergola分析数据（步骤3到6）。使我们能够使用基因组软件分析数据（参见Espinosa-Carrasco et al。，2018b）并简化其可视化等操作。

我们创建了一个Perl脚本来解析这些文件， mtb2int.pl 以间隔的形式聚合来自单个文件中多个MTB文件的所有数据。

mtb2int.pl recording_1.mtb recording_2.mtb ... recording_n.mtb -startTime file tac -renames cages Y -out＆gt; />
参数：
recording_1.mtb to recording_n.mtb：Phecomp cages记录的MTB文件。
-startTime文件tac：使用文件的时间戳来设置初始时间点。
-rename Cages Y：当同时处理多批笼子时，将其他批次的ID设置为从上一次使用的数字值开始批量加1. n + 1前值。
-out：将结果间隔打印到标准输出。
intervals_feeding.int：包含已解析间隔的输出文件。
第二个Perl脚本， int2combo.pl，过滤器，摄入量小于0.02 g，合并进食/饮水行为（吃饭间隔短于120秒，见上文）并将数据格式化为逗号分隔值（CSV）文件。

int2combo.pl interval_feeding_act.int-tag field value max 0.02 -filter action rm -bin -compulse -out output R＆gt; >
参数：
intervals_feeding.int：包含已解析间隔的输入文件。
-tag字段值最大值0.02 -filter action rm -bin：设置要过滤的字段，值和条件。
intervals_feeding.csv：包含进气间隔的输出文件。

注意：重现步骤3到5和6的数据已存档在Zenodo上，可以通过以下链接访问 https://doi.org/10.5281/zenodo.2668520。
使用pergola将上一步生成的CSV文件转换为包含喂食行为（膳食）的BED文件。

pergola -i intervals_feeding.csv -m mapping.txt -f bed -e -dl food_sc food_fat -d all

参数：
- i intervals_feeding.csv：输入包含用餐间隔的CSV文件。
- m mapping.txt：用于描述输入文件内容的映射文件。
-f bed：输出格式。
- e：数据的第一个时间点变为零时间。
-dl food_sc food_fat -d all：要保留的数据类型。
每个窗口值将对应于单个鼠标的所有摄入量的总和。
使用1,800秒的时间窗口进行食物摄取，并将数据格式化为床图文件。
pergola -i intervals_feeding.csv -m mapping.txt -f bedGraph -w 1800 -e -dl food_sc food_fat -d all

参数：
- i intervals_feeding_bout.csv：输入包含用餐间隔的CSV文件。
- m mapping.txt：用于描述输入文件内容的映射文件。
- f bedGraph：输出格式。
- w 1800：创建1800秒的窗口并总结相应窗口内的摄入量。
- e：数据的第一个时间点变为零时间。
-dl food_sc food_fat -d all：要保留的数据类型。
昼夜节律喂养节律性的可视化（图3）。所得到的BED和床图文件可以使用诸如IGV的桌面基因组浏览器可视化.IGV需要定义数据被映射到的基因组序列的参考序列。有关如何为其可视化上传数据的详细说明，请参阅pergola文档（ http://cbcrg.github.io/pergola/visualization.html#igv ）。

每个行轨迹显示30分钟时间窗口内的小鼠累积食物摄入量为条形图。每行显示单个个体的数据。注意在居住阶段（底部轨道灰色）喂养的昼夜节律微观结构以及DIO暴露时食物摄入节律性如何丧失（DIO启动由底部轨道中的黑色表示）。实验设计轨迹可以在Zenodo存档数据中找到，请参阅下的注释。条件2鼠标及其对照的实验的第一周的周期设计（条形图以黑色和灰色显示轨迹，相当可观）。纵向分析第2步。
或者，可以使用Pergola Web服务器执行步骤3到5（Espinosa-Carrasco et al。，2019）。如图4所示，处理数据的确切选项如图4所示。

图4.用于获取可视化的Pergola Web服务器选项，如图3所示。这组选项显示如何配置服务器以获取数据的纵向可视化。＆nbsp;

笔记

在连续测试之间的时间内，根据组的不同，小鼠的饮食条件保持不变。＆nbsp;
由于所使用的测试可能改变食物摄入模式，因此在测试之间的日子里为动物提供足够的时间来重建其先前的食物摄入模式是很重要的。因此，测试按照设定的顺序进行，旨在最小化在以下测试中进行测试并且具有足够的测试间间隔以允许小鼠重新建立其先前的进食行为。
必须从笼子中取出巧克力混合物和高脂肪，并每周更换两次新鲜食物，以确保混合物的质量，质地和性能是最佳的。
PheCOMP笼每2周清洁一次。
PheCOMP笼必须仔细清洁，以避免任何其他食物或木屑干扰信号转导。

致谢

MD的实验室由DIUE delaGeneralitàdeCatalunya支持（Grups合并SGR 2017/926）。这项工作得到了JérômeLejeune基金会的支持（巴黎，巴黎）法国），MINECO（SAF2016-79956-R），CDTI（'Smartfoods'），欧盟（Era Net Neuron PCIN-2013-060）和加泰罗尼亚基金会'LaMaratódeTV3'（＃2016 / 20-30）和欧盟联合计划 - 神经退行性疾病研究（JPND）项目，根据拨款协议HEROES AC17 / 00006. CRG是卓越中心Severo Ochoa SEV-2012-0208。

竞争利益

作者没有利益冲突申报。

道德

欧洲（欧盟指令no 86/609，欧盟法令2001-486）规定和所有实验方案的使用标准均按照适当护理和使用实验动物的建议进行[当地（法律32/2007）;实验动物编号A5388-01（NIH）]并经当地伦理委员会（CEEA-PRBB）批准。

参考

Avena，NM，Rada，P。和Hoebel，BG（2009）。糖和脂肪肆虐成瘾行为的显着差异。 J Nutr 139（3）：623-628。
Bura，SA，Burokas，A.，Martin-Garcia，E。和Maldonado，R。（2010）。慢性尼古丁对CB 1 敲除小鼠的食物摄入和焦虑样行为的影响。 Eur Neuropsychopharmacol 20（6）：369-378。
Di Segni，M.，Patrono，E.，Patella，L.，Puglisi-Allegra，S。和Ventura，R。（2014）。综合饮食行为的动物模型。营养素 6（10）：4591-4609。＆nbsp;
Ellacott，KL，Morton，GJ，Woods，SC，Tso，P。和Schwartz，MW（2010）。评估实验室小鼠的摄食行为。细胞代谢 12（1）：10-17。
Espinosa-Carrasco，J.，Burokas，A.，Fructuoso，M.，Erb，I.，Martin-Garcia，E.，Gutierrez-Martos，M.，Notredame，C.，Maldonado，R。和Dierssen，M。（2018）。能量密集食物引起的行为相关行为变化的时间过程和动态在小鼠中。 Addict Biol 23（2）：531-543。
Espinosa-Carrasco，J.，Erb，I.，Hermoso Pulido，T.，Ponomarenko，J.，Dierssen，M。和Notredame，C。（2018）。 Pergola：通过解锁基因组分析工具，促进纵向数据的可视化和分析。 iScience 9：244-257。＆nbsp;
Espinosa-Carrasco，J.，Hermoso Pulido，T.，Erb，I.，Dierssen，M.，Ponomarenko，J。和Notredame，C。（2019）。 Pergola-web：使用重组基因组学工具和标准可视化和分析纵向行为数据的网络服务器。核酸研究 47（w1）：w600-w604。＆nbsp;
Goltstein，PM，Reinert，S.，Glas，A.，Bonhoeffer，T。和Hübener，M。（2018）。食物和水的限制导致了针对老鼠的头部固定的双选视觉辨别任务中的差异学习行为。 PLoS One 13（9）：e0204066。
Heyne，A.，Kiesselbach，C.，Sahun，I.，McDonald，J.，Gaiffi，M.，Dierssen，M。和Wolffgramm，J。（2009）。适应性食物摄取行为的动物模型。 Addict Biol 14（4）：373-383。
Robinson，JT，Thorvaldsdóttir，H.，Winckler，W.，Guttman，M.，Lander，ES，Getz，G。和Mesirov，JP（2011）。综合基因组学查看器。 Nat Biotechnol 29（1）：24-26。
Senst，L.，Baimoukhametova，D.，Sterley，TL and Bains，JS（2016）。性二态神经元对社会孤立的反应。 Elife 5：e18726。
Toa，LA和Gardiner，TW（2000）。食物和水限制协议：生理和行为考虑因素 Contemp Top Lab Anim Sci 39（6）：9-17。
Towell，A.，Muscat，R。和Willner，P。（1987）。匹莫齐德的影响关于蔗糖的消费和偏好。 Psychopharmacology（Berl） 92（2）：262-24。
Tucci，V.，Hardy，A。和Nolan，P。（2006）。比较经历食物或水限制的C57BL / 6J小鼠的生理和行为参数。 Behav Brain Res 173（1）：22-29。