材料和试剂

材料
1. 移液器吸头（Corning，Axygen，目录号：T-1000-B，T-200-Y，T-300）
2. 100毫米培养皿（Thermo Fisher，Nunc，目录号：150462）
3. 35毫米玻璃底培养皿（Thermo Fisher，目录号：150682）
4. 1.5毫升Eppendorf管（Corning，Axygen，目录号：MCT-150-C）
5. 50毫升，15毫升离心管（Thermo Fisher，目录号：339652,339650）
6. Gene Pulser（Bio-Rad，目录号：165-2086）
生物材料
1. 3T3-L1前体细胞（ATCC，目录号：CL-173）
2. Cidec-GFPN1质粒（Wang et al。。，2018;根据要求可从相应作者处获得）
注意：将全长Cidec基因（NCBI登录号：NM_178373）插入XhoI和EcoRI限制酶位点的pEGFPN1质粒中。
试剂
1. BODIPY 558/568 C12（Thermo Fisher，Molecular Probes，目录号：D3835）
2. 油酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：O7501）
3. Dulbecco改良的Eagle's培养基（DMEM），高葡萄糖，含L-谷氨酰胺和酚红（Gibco，目录号：11965084）
4. 胎牛血清（FBS）（Gibco，目录号：16140071）
5. 青霉素 - 链霉素混合溶液（P / S）（Gibco，目录号：15140122）
6. 电穿孔缓冲液（Bio-Rad，目录号：1652676）
7. 胰蛋白酶-EDTA（Thermo Fisher，Life Technologies，目录号：25200-072）
8. NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S3014）
9. KCl（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
10. Na 2 HPO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：S5136）
11. KH 2 PO 4 （Sigma-Aldrich，目录号：P9791）
12. CaCl 2 （Sigma-Aldrich，目录号：C5670）
13. MgCl 2 （Sigma-Aldrich，目录号：M4880）
14. 磷酸盐缓冲盐水（PBS）（见食谱）

设备

移液器（Gilson，型号：PIPETMAN P10，P20，P200，P1000）
细胞计数室（Easybio，目录号：BE6138）
37°C，5％CO 2 细胞培养箱（NuAire，型号：NU-49SOE）
生物安全柜（NuAire，型号：NU-425-400E）
离心机（Cence，中国，型号：TDZ5-WS）
电穿孔（Lonza，型号：Amaxa Nucleofactor II）
共聚焦荧光显微镜（尼康仪器，型号：尼康A1 +共聚焦显微镜）
活细胞站（Oko实验室，型号：A1 Confocal）
电脑（联想，型号：ThinkStation P510）

软件

NIS元素分析（尼康， https://www.microscope.healthcare.nikon.com/产品/软件）
斐济（NIH软件， http://fiji.sc/Fiji ）
基于ImageJ的基于开源插件的图像分析软件（ https://imagej.nih.gov/ij/ < / a>）
LabVIEW 8.5带有NI Vision 8.6模块的插件安装（National Instruments， http://www.ni.com/en-us/support/downloads/software-products/download.labview.html ）
定制的LabVIEW模块：
1. 1_Exchange rate assay.llb（应用于数据分析的步骤B）
2. 2_检查拟合region.vi（在数据分析的步骤C中应用）
3. 3_兑换rate.vi（应用于数据分析的步骤D）
Prism 5（GraphPad Inc.）

程序

理论：为了估计LD融合能力，我们测量脂质交换率作为两个接触的LD之间潜在孔径的替代指标。为了测量活细胞中LDs之间的脂质交换速率，用BODIPY-C12预染色的每个LD对的小（供体）LD被光漂白。荧光标记的脂质在大（受体）中记录光漂白之前和之后的小和大（受体）LD的图像，并将它们的荧光强度归一化为大LD的初始荧光强度。光漂白后0秒，大LD的初始强度比为1，光漂白小LD的荧光强度与0时的大LD的比率表示为 G > 0 。之后的任何时间光漂白，大强度小LD的时间相关比率表示为 G 1 （ t ）和G 2 （ t ），可观的是，中性脂质分子的时间不变的汇率（∅ e ）根据常规微分方程，根据LD对中荧光恢复率的测量计算LD对之间的关系：

其中 V 1 和 V 2 分别代表小型和大型LD的体积。详细的等式推导显示在补充信息。

整体程序
活细胞中LDs的脂质交换率测定程序如图1所示。

图1.活细胞中LD脂质交换率测量的示意图
细胞制备
1. 在10ml塑料培养皿中在10ml补充有10％FBS，100μg/ ml链霉素和100U / ml青霉素的DMEM中培养3T3-L1前脂肪细胞。
2. 使用5ml DMEM终止该过程。将细胞用DMEM转移到15ml管中并在150μl离心机中离心3分钟，在80％汇合时，用2ml 0.25％胰蛋白酶溶液对细胞进行胰蛋白酶消化。丢弃上清液。
3. 使用1ml PBS重悬细胞。
4. 使用细胞计数室计数细胞。
5. 在150 x g 下离心3分钟，弃去上清液。
6. 用合适的电穿孔缓冲液重悬细胞，使细胞密度达到2-3×10 6 sup / ml。
7. 吸出100μl细胞，在1.5ml Eppendorf管中与0.5-1μg质粒（Cidec-GFP）混合。
8. 将细胞DNA混合物转移到genepulser中，将genepulser置于Nucleofector II中，选择针对3T3-L1前脂肪细胞转染进行优化的程序A-033，执行电穿孔步骤。
9. 向基因推进器中加入100μlDMEM，将混合物吸出到带有2ml DMEM培养基的15ml离心管中。
10. 将BODIPY-C12 558/568加入培养基中至终浓度为1μg/ ml。
11. 将油酸钠溶液加入培养基中至终浓度为200μM，以提供LD形成和细胞生长的脂质。
12. 加入上述试剂后，将混合物吸入35mm玻璃底培养皿中，在37℃，5％CO 2 的培养箱中孵育18-20小时。
13. 用2ml新鲜DMEM更换培养基有两个原因：1）从培养基中除去BODIPY-C12染料以消除背景荧光; 2）除去油酸钠以减少甘油三酯合成对LD融合的影响。接下来，在FRAP实验之前将培养物与细胞一起放置在培养箱中1小时，以帮助细胞具有改变的培养基。
光漂白（FRAP）图像采集后的荧光恢复
在这里，我们使用尼康A1共焦显微镜进行FRAP测量作为一个例子。当使用其他配置示波器时，以下程序也可用于FRAP实验。
1. 打开活细胞站，将温度设置为37°C，打开5％CO 2，在加热槽中加入适量的双蒸水。
2. 选择100x机油软件。启动Nis-element软件。在共聚焦显微镜，激光发生器，显微镜灯，电动自动平台，z轴压电平台和计算机工作站上选择100x油轮。让细胞在物镜上滴加浸油，将35毫米玻璃底培养皿放在样品架上，调节高度至物镜以浸没培养皿。如果可能，可容纳1小时，或至少0.5小时，以确保以下测量的稳定性。
3. 设置显微镜的参数，如图2所示。单击通道按钮，选择“异硫氰酸荧光素（FITC）”和“四甲基罗丹明（TRITC）”通道。在通道系列中选择“无”。要捕获荧光图像，可以有几种商用显微镜，但它们对设置参数的定义不同。这里，我们以尼康A1闭合显微镜为例，显示优化激光功率的设置和灵敏度的增益。激光功率“表示实际激光功率的水平，”HV“表示检测器的增益（图像的亮度），”偏移“表示检测器的灵敏度（图像的对比度）。 TRITC激光器“0.3”，HV“60-120”，关闭设置为“0”。在561 nm波长下将针孔设置为原位。将扫描尺寸设置为“512 x 512像素”，扫描速度“1 f rame / s“，缩放”3.0“，行平均”无“。
  
  图2.图像采集的NIS元素设置。图像显示激光通道的设置，激光功率，HV，偏移，针孔尺寸，扫描尺寸，扫描速度以及图像的其他详细参数收购。
4. 设置光漂白参数：
  1. 打开光活化界面，如图3所示。将刺激扫描速度设置为0.25秒/帧。
    
    图3.光漂白的NIS元素设置。图像显示了激光功率和光漂白扫描速度的设置。
  2. 转到N维（ND）刺激界面，如图4所示，我们可以设置捕获的一些图像的XYZ位置和时间表选项。创建与时序操作中的三个步骤相对应的三个阶段在阶段1中，在Acq / Stim中选择“采集”，在间隔中选择“无延迟”，持续1.06秒和1个循环以捕获一个图像，其显示在光漂白之前LD对的初始荧光强度。另外，在阶段2中，在Acq / Sim中设置“Stimulation”，在ROI中设置“S1”，在1个循环中设置进行光漂白。刺激持续时间将根据设置自动设置图3中的刺激扫描速度。在阶段3中，选择Acq / Stim中的“Acquisition”，时间间隔为“1.06 s”，30（快速汇率）或50（慢速汇率）循环以捕获时间推移图像时间间隔为1.06秒，记录荧光的变化随后，自动计算持续时间。选择“执行时间测量”。选中“保存到文件”，输入路径并命名文件。
    
    图4. ND刺激的NIS元素设置。图像显示了与ND刺激设置中的三步时序操作相对应的三个阶段。
  3. 该界面用于监测所选区域的荧光信号随时间的变化。
5. 找到目标LD对：
  1. 使用水银灯照明，选择LD对，以及LD-LD接触点（LDCS）富集的GFP信号，如图所示LD的直径优选在3至6μm的范围内选择以减少变化。
    
    图5.合适的LDCS的示例图像。该图像显示BODIPY-C12染色的LD对的红色信号和在LDCS富集的Cidec-GFP的绿色信号。
  2. 单击“A1”按钮切换到计算机控制模式。单击按钮＆nbsp;
  3. 单击“实时”按钮预览LD对。将界面上的光标移动到LDCS，右键单击鼠标，选择“将点移动到中心位置”。调整GFP和TRITC通道中的HV以获得最高荧光强度而不会过度曝光图像“将LD对置于视觉中心。一旦LD对失焦，滚动鼠标以调整物镜的焦平面。按下显微镜前面板上的“PFS”按钮，在采集过程中锁定成像平面。
  4. 单击ROI按钮，如图6所示，选择圆形圆圈，在其中心绘制一个覆盖供体LD约70％面积的圆圈，并表示为S1（刺激ROI）。光致LDs的原因描述于接下来，在供体LD的中心绘制约70％的供体LD面积的另一个圆;在受体LD的中心绘制约70％的受体LD的第三个圆。选择70％面积的原因取决于我们使用最佳HV值和漂白激光功率的经验。可以根据具体情况调整百分比面积。此外，此处的ROI选择仅用于预览论文LD中BODIPY-C12染料的实时荧光强度，并预先检查荧光恢复数据。
    
    图6. ROI设置。图像显示了LD上的圆的ROI和圆形示意图.S1，LD对的供体LD上的光漂白区域;圆2，光漂白的监测ROI Donor LD; Circle 3，受体LD上的监测ROI。
6. 在此过程之前，确保LD对已在成像平面上准备就绪并且所有参数都已正确设置。单击ND刺激界面中的“立即运行”按钮并允许程序完成。
7. 寻找下一个LD对并重复步骤C5和C6以获取一系列LD对的FRAP数据。

数据分析

具体来说，第一种方法是使用Fuji软件进行部分手动测量。第二种方法是使用LabVIEW程序中的定制代码进行全自动测量。下面，我们将演示两种可供选择的方法来分析FRAP图像数据。但是，在LD对的情况下，使用上述两种方法测量的最终FRAP结果几乎相似。例如，对于直径小于1μm的LD。但是，如何定制LabVIEW程序的潜在限制来处理FRAP数据的任何条件，我们还提供了处理最困难情况的手动方法。如果可能，我们建议使用自动方法。

BODIPY-C12染色LDs的强度平均值（MOI）和大小测量值手册
1. 打开斐济软件。
2. 转到“文件”→“导入”→“图像序列”，打开一系列时序图像（8位 TIF格式文件，图7中的数据用作示例）
  
  图7.导入一系列8位TIF格式图像。 A.斐济软件菜单.B。导入图像序列的序列选项C.代表时间序列集图像输入.D。输入图像的比例。
3. 校准后的刻度为12.107像素/μm，如图7D所示。要设置图像的比例尺，请转到“分析”→“设置比例”。
4. 获得一系列随时间变化的大LD的“平均灰度值（平均值）”信息。
  1. 使用“椭圆”工具选择至少70％的大LD区域。
  2. 转到“分析”→“测量”，得到大LD的“面积”，“平均灰度值（平均值）”，“最小灰度值（最小值）”和“最大灰度值（最大值）”信息。
  3. 按下图7C右下方的“►”按钮或键盘上的“>”按钮，转到顺序图像的下一帧。
  4. 单击所选圆的中心，然后通过拖放将圆移动到下一帧中大LD的中心。
  5. 重复步骤b到d以获得大LD到最后一帧的一系列信息（图8）。
    
    图8.由斐济量化的一系列延时荧光图像中大LD的“平均灰度值（平均值）”数据。此处，此图像中分析的帧总数为91时间间隔为1.12秒
5. 将大型LD的数据集保存为Excel文件。
6. 随着时间的推移获得一小部分LD的“平均”信息。
  1. 按下后退按钮“◄”，如图9A左下方所示，或按下键盘上的“<”按钮返回顺序图像的第一帧（例如，按顺序设置的91张图像按90次）。
  2. 使用“椭圆”工具重新选择至少70％的小LD区域。
  3. 转到“分析”→“测量”，得到小LD的“面积”，“平均灰度值（平均值）”，“最小灰度值（最小值）”和“最大灰度值（最大值）”信息。
  4. 按“►”或“>”按钮转到顺序图像的下一帧。
  5. 单击所选圆的中心，然后通过拖放将圆移动到下一帧中小LD的中心。
  6. 重复步骤c-e，得到小LD到最后一帧的一系列信息（图9）。
    
    图9.斐济量化的一系列延时荧光图像中小LD的“平均灰度值（平均值）”数据
7. 将小文件的数据集保存为Excel文件。
8. 随着时间的推移，在大LD的区域内获得一系列“尺寸”信息。
  1. 按后退按钮“◄”或“<”返回顺序图像的第一帧（例如，按顺序设置的91张图像按90次）。
  2. 使用“Line”工具测量大LD的大小。
  3. 转到“分析”→“测量”，得到“面积”，“平均灰度值（平均值）”，“最小灰度值（最小值）”，“最大灰度值（最大值）”，“角度”和“长度”对于以下分析过程，仅需要“长度”信息。
  4. 按“►”或“>”按钮转到顺序图像的下一帧。
  5. 重复步骤bd以获得大LD到最后一帧的一系列大小信息（图10）。
    
    图10.斐济量化的一系列延时荧光图像中大型LD的“尺寸”数据
9. 将大型LD的数据集保存为Excel文件。
10. 随着时间的推移获得一小部分LD的“尺寸”信息。
  1. 按后退按钮“◄”或“<”返回顺序图像的第一帧（例如，按顺序设置的91张图像按90次）。
  2. 使用“线”工具测量LD的大小，通过对大LD测量重复相同的步骤8b-8e，获得具有最后帧的小LD的一系列信息（图11）。 >
    
    图11.斐济量化的一系列延时荧光图像中小LD的“尺寸”数据
11. 将小文件的数据集保存为Excel文件。
12. 接下来，将数据集重新格式化为新的Excel文件，如图12所示：随时间变化的MOQ，随时间的连续MOI，仅需要来自强度测量的“平均”值和来自尺寸测量的“长度”值。现在，数据已准备好用于数据分析的步骤C中的辅助分析。
  
  图12.在新的Excel文件中合并和重新格式化数据集
  
  13.在Excel软件中绘制LD对的两个感兴趣区域的连续MOI（图13）。
  
  图13.连续MOI随时间的变化
使用自动识别程序测量BODIPY-C12染色LD的MOI和尺寸
1. 打开LabVIEW软件（此处使用带有NI Vision 8.6模块插件安装的LabVIEW 8.5版本）。
2. 双击LabVIEW sub-llb文件“1_Exchange rate assay.llb”打开主模块“Main program.Vi”，如图14所示。子VI程序的界面如图15所示。
  
  图14. LLB管理器的对话框
  
  图15.主模块“主程序.vi”的界面。红色星号表示标准程序中的一组常规步骤。按照步骤获取每对信息的一系列信息中的一系列信息时间。
3. 随着时间的推移获得大小LD的一系列“均值”信息。
  1. 设置图15中标有“Scale”的输入图像的比例（此处使用12.107像素/μm的值）。
  2. 通过按下图15中“步骤1”标记的按钮运行子VI程序，或者按下组合键盘按钮“Ctrl + R”。
  3. 按下图15中“步骤2”标记的“加载文件”，打开一系列时序图像（8位TIF格式文件，此处使用图16A的数据作为示例）。
  4. 通过拖放直接在图像上选择具有默认“方形”工具的整个大LD区域，如图16B所示，并按下图15中“步骤3”标记的“学习大模板”以记录模板图像大LD的。
  5. 对小LD重复步骤d：用“方形”工具选择整个小LD区域，如图16C所示，并按下图15中“步骤4”标记的“学习小模板”，记录小LD的模板图像
    
    A.根据计算机存储器将一对LD对的时间顺序图像加载到计算机中并相应地在界面上显示B.用“Square”工具选择的大LD的模板图像，并记录到计算机存储器中作为下一帧中的大LD的后续识别的参考C.模板图像比例尺，5μm。
    使用“Square”工具选择小LD并将其记录到计算机中作为参考，用于下一帧中的小LD的后续识别。
  6. 在搜索测试菜单中选择“大”或“小”，并按下图15中标记为“步骤5”的“搜索”按钮，以确认所选大或小LD的准确识别。）。
    
    图17.确认已识别的LD大小。选择“大”（A）或“小”（C）以检查所选大（B）或小（D）LD的标识是比例尺，5微米。
  7. 在搜索测试菜单中选择“大”并按下图15中“步骤6”标记的“分析”，得到一系列“帧”，“平均灰度值（平均值）”，“最小灰度值（最小值）” ），以及大LD随时间的“大小”信息自动。
  8. 在“搜索测试”菜单中选择“小”并再次按“分析”按钮以获得一系列“帧”，“平均灰度值（平均值）”，“最小灰度值（最小值）”和“大小”信息随着时间的推移，小LD自动。
  9. 按由“步骤2”，在图15中输入标记下一组时间顺序图像并重复步骤dh以获取下一系列信息完成LD对的MOI测量后。
    注意：按“加载文件”或“返回”按钮后，较大和较小LD的一系列均值和大小信息将自动保存为Excel文件。生成的Excel文件已准备好格式数据分析的步骤C中的辅助分析。
4. 检查先前保存为Excel文件的LD对的数据集（此处使用两组数据作为示例）。
5. 在Excel软件中绘制各个LD对中两个感兴趣区域的连续MOI随时间的变化（图18）。
6. 将具有相同数据的文件夹传输到LabVIEW子VI的相同文件夹中“2_Check a fitting region.vi”和“3_Calculation of exchange rates.vi”文件。
  
  图18.连续MOI随时间变化的情节。（A）中显示的数据与图13中显示的数据相同.B。相比之下，使用另一组时间序列图像获得MOI在数据分析的步骤B3i中提到。
预测汇率强调线性标准
在成像过程并获得在数据分析的步骤A或B中生成的“MOI”和“长度”信息之后，Excel文件现在可用于以下分析。 br />
1. 打开LabVIEW软件。
2. 打开LabVIEW子VI“2_检查拟合区域.Vi”文件。子VI程序的界面如图19所示。
  
  图19.子VI的界面“2_Check a fitting region.vi”。这里使用图18B中的数据作为示例。
3. 获得LD对汇率的最佳拟合范围。
  1. 按下图19中“Periodic running”标记的按钮，运行sub-VI程序。
  2. 调整以通过图19中的“拟合范围”选择拟合范围的最大值，以确保调整的拟合线的线性度（MSE）和重复性（％）满足最佳值（MSE <0.01且％<＆lt;＆lt; 30％）。我们将两个上限值定义为线性标准。
  3. 记录每组测量的LD对的最佳拟合范围。
计算各个融合LD对之间的汇率
1. 打开LabVIEW子VI“3_Calculation of exchange rate.Vi”文件。子VI程序的界面如图20所示。
  
  图20.子VI的界面“3_Calculation of exchange rates.vi”
2. 在“最佳拟合范围”标记的表格中输入所有最佳拟合范围，如图21A所示。
3. 如图21B所示，针对大或小LD尺寸绘制汇率。
  按“Ctrl + R”运行子VI程序以获得汇率的平均值±SD值。
  
  图21.运行子VI“3_计算汇率.vi”的结果。 A.最佳拟合范围表B.显示汇率与大型和小型LD的大小的关系图。。

笔记

光漂白过程的简要描述必须在三个LD的较小（即供体）LD上进行三次以进行统计分析，如我们的原始出版物中所述（Wang et al。，2018）。简短，因为那里在较大的LD中，荧光分子更多，将这些大的LD光漂白两倍以上将导致LD对中荧光强度的快速下降，并且导致荧光恢复检测的困难。
该协议中最关键的步骤是获得三个拟合线的最佳线性度（mse）和重复性（％），如“程序C”中所述。如果三个循环中的拟合线的评估线性或重复性为mes。这些不稳定的汇率可能在采集间隔期间发生。这些不稳定的汇率可能由LD对的物理尺寸变化，成像平面的高度引起。我们建议测量50组或更多的脂质交换率。一般来说，30-40次脂质交换事件足以满足标准，如果获得的话。最佳环境控制条件。

食谱

磷酸盐缓冲盐水（PBS）
1. 混合1.37M NaCl，25mM KCl，8mM Na 2 HPO 4 ，14.7mM KH 2 PO ，9毫升CaCl 2 和5 mM MgCl 2 在900毫升去离子H 2 O中
2. 调整至最终pH 7.4
3. 将去离子H 2 O加入1,000ml
4. 高压灭菌器存储（这是10倍PBS库存）
5. 用去离子H 2 O稀释PBS原液至1×PBS

致谢

这项工作得到了国家研究计划拨款2018 YFA 0506900（PL）和国家自然财富的资助，清华大学P. Li实验室成员中国科学基金会的资助91857103（到FJC），31430040，31690103和31621063（以PL），该协议是从我们以前的出版物适用于在生物化学杂志（王的等的，2018 ）。

竞争利益

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

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