材料和试剂

微核试验
1. 乳胶手套（KCWW，Kimberly-Clark，目录号：57330）
2. 移液器吸头（无菌）
3. 100毫米培养皿（SARSTEDT，目录号：83.3902），用于贴壁细胞的哺乳动物细胞培养容器
  注意：适合您细胞系的任何其他培养皿或培养瓶均可使用。
4. 显微镜载玻片（UltiDent Scientific，目录号：170-7107A）
  注意：可以使用适合显微镜的任何显微镜载玻片。
5. 盖玻片（UltiDent Scientific，目录号：170-C1818）
  注意：可以使用任何防护玻璃。最好的防护眼镜是＃1.5;但是如果不需要高质量的图像，可以使用＃1.0或＃0。
6. 6孔组织培养处理板（Corning，目录号：3506）
7. 24孔组织培养板（康宁，目录号：3524）＆nbsp;
8. 哺乳动物非癌性贴壁细胞，例如MRC-5，HCEC，HaCaT细胞，等。
9. 必需的完整文化媒体＆nbsp;
  1. DMEM（WISENT，目录号：319-005-EL）
    注意：生长培养基适用于每种细胞系。请与细胞系供应商确认细胞的最佳生长培养基和必要的补充剂。
  2. 胎牛血清（FBS）（WISENT，目录号：095150）
    注意：通常使用10％v / v溶液，但某些细胞系需要不同的浓度。请咨询您的细胞系供应商。＆nbsp;
  3. 青霉素/链霉素（WISENT，目录号：450-201-EL）
    注意：它通常作为100x库存提供，必须在DMEM中以1：100稀释。
  4. L-谷氨酰胺（Sigma-Aldrich，目录号：G3126）
10. 胰蛋白酶（PBS中0.05％或0.25％）（Thermo Fisher Scientific，GibcoTM，目录号：25200072）
11. 磷酸盐缓冲盐水（PBS，1x）（Sigma-Aldrich，目录号：P-4417）
12. 氯化钾（KCl）（Sigma-Aldrich，目录号：P9541）
13. 乙酸（Sigma-Aldrich，目录号：320099）
14. 甲醇（Sigma-Aldrich，目录号：34860）
15. 吖啶橙（Sigma-Aldrich，目录号：A8097）
16. 70％乙醇
17. 金属元素（IC 50 值）
18. FBS
Allium cepa 测定
1. 洋葱鳞茎（ Allium cepa ），直径约1.5-2.0厘米
2. 剃刀刀片
3. 移液器吸头
4. 玻璃显微镜载玻片（75 x 25 mm）（VWR，目录号：48300-025）
5. 盖玻片（Fisher Scientific，目录号：12-543D）
6. Eppendorf管1.5 ml（VWR，目录号：89000-028）
7. 试管（10 ml）（BOROSIL，目录号：9820U04）
8. 铅笔用橡皮擦
9. 指甲油（硝酸纤维素溶于丁基和乙酸乙酯）
10. 双蒸水（ddH 2 O），用于生化实验的高纯度实验室水的标准。
11. 盐酸（例如，Merck，目录号：HX0603-75）
12. 乙酸（例如。，Merck，目录号：AX0073-6）
13. Schiff的试剂（HiMedia Laboratories，目录号：S074-500ML）
14. 指甲油

设备

微核试验
1. 层流罩
2. 血球
3. 移液器（任何移液器都可以）
4. 孵化器（如果它保持5％CO 2 和水分，任何孵化器都很好）
5. 由尼康NIS-Elements软件控制的高灵敏度相机（ANDOR，型号：Zyla 5.5）的荧光显微镜（尼康仪器，型号：Eclipse E800）
Allium cepa 测定
1. 孵化器
  注意：如果保持25°C和37°C，50-60％湿度和12小时照明/ 12小时黑暗48小时，任何孵化器都可以。
2. 光学显微镜（奥林巴斯，10倍物镜）
3. 数码相机（尼康，型号：COOLPIX P100,1030万像素，26倍变焦）

软件

对于微核测定和 Allium cepa 测定：Microsoft Office Excel

程序

微核试验
1. 细胞制备
  1. 根据细胞的需要培养细胞（例如，MRC-5，HCEC，HaCaT细胞系，等）。
  2. 取出培养基，然后用10 ml PBS冲洗细胞两次，每次洗涤后取出PBS。PBS应在使用前进行高压灭菌。
  3. 向细胞中加入1ml 0.25％胰蛋白酶，在37℃下孵育1-5分钟直至细胞呈圆形。
  4. 加入10ml含10％FBS的培养基，用移液管分离细胞。
  5. 使用血细胞计数器计数细胞。
    注意：每次相对准确的细胞数量至关重要。
  6. 准备所需的接种浓度，然后将细胞接种到培养皿或6孔板中。
2. 在盖上眼镜上生长细胞
  用于接种的细胞数应当通过每个培养皿中每个培养皿或每孔中适当数量的细胞的细胞数确定，至少一式两份。例如，MRC-5细胞以2×10 4个细胞/孔的密度接种，HCEC细胞以15×10 4个细胞/孔的密度接种将细胞在37°C的CO 2培养箱中孵育24小时，并使它们附着在培养皿/培养皿上。
  1. 在电镀之前，将无菌盖玻片放入6孔板的每个孔中。
    注意：
    1. 或者在6孔板的一个孔中不超过2个盖玻片，或者在60mm盘中不超过5个盖玻璃。＆nbsp;
    2. 确保盖玻片和组织培养皿之间没有气泡。
  2. 必要时用金属药物处理细胞（50 IC值，对抗永生化的非癌细胞）。
  3. 将细胞在37°C的CO 2 培养箱中孵育48小时。
3. 固定和染色
  注意：轻轻处理洗涤固定或染色步骤中的溶液。
  1. 48小时后取出培养基，然后用3ml PBS冲洗细胞三次。＆nbsp;
  2. 除去PBS并加入2-3ml低渗溶液（75mM KCl）溶液，并将培养皿/培养皿置于室温（RT）下10分钟。
  3. 重复该过程三次。取出KCl，通过快速冲洗程序至少三次更换1/3乙酸/甲醇固定细胞。冷甲醇含1％醋酸。＆nbsp;
  4. 加入3ml吖啶橙溶液（5μg/ ml -1 ）并在37℃下孵育15分钟。
  5. 去除吖啶橙，将盖玻片用3毫升PBS冲洗三次，以去除任何多余的吖啶橙色污渍。＆nbsp;
  6. 从井中取出盖玻片，将其放在PBS滴上，将其拧紧并固定在载玻片上。＆nbsp;
  7. 现在可以在荧光显微镜下观察载玻片了。
Allium cepa 测定（图1）
1. 从当地杂货店购买新鲜的洋葱鳞茎（ Allium cepa ，直径约1.0-1.5厘米）。
2. 去除并丢弃最外面干燥的棕色层而不破坏根原基。
3. 将 Allium cepa 的球茎放在含有双蒸水的试管（10 ml）上。
4. 将试管置于25℃，50-60％湿度和12小时照明/ 12小时黑暗的培养箱中24小时。
5. IC 50 sub>对于癌细胞系的金属药物的值应该在该浓度范围内。
6. 将 Allium cepa 球茎（每剂量两个）与金属药物一起孵育48小时。
7. 48小时后，将根部转移到试管中，加入5-10ml 1：3乙酸 - 甲醇溶液，在4℃下孵育24小时。如果没有观察到根，则可在70℃下保存几天。％乙醇。
8. 将根在含有1.0-1.5ml 6N HCl的Eppendorf管中于37℃转移10分钟。
9. 除去HCl并在蒸馏水中洗涤根部1分钟。
10. 将根尖转移到Eppendorf管中，加入1.0-1.5毫升希夫试剂。
11. 将根尖在37°C孵育40分钟。
12. 在45％乙酸中洗涤根尖1分钟。
13. 处理的根长度应为约0.5-2.0厘米。用剃刀刀片从染色良好的根尖上取下根冠。
14. 在干净的显微镜载玻片上用一滴45％的乙酸将盖玻片放在安装溶液上。用于覆盖盖玻片整个表面的溶液，避免气泡。使用铅笔的橡皮擦末端压入单个细胞以施加压力。
15. 用指甲油密封覆盖层的边缘。
16. 现在可以在荧光显微镜下观察载玻片了。
图1. Allium cepa 测定的实验步骤

数据分析

微核试验
1. 计算每1,000个细胞中微核细胞的数量。
2. 计算微核的百分比（％），作为微核与1,000个细胞数的比率。
  注：根据先前建立的标准鉴定微核：（1）MN的面积应对应于主核面积的1/256和1/9，（2）微核的形状应为（4）微核应易于与人工制品区分开来。（4）微核不与主核连接或连接，（5）微核可能接触，但不与主核和微核重叠从核边界和（6）微核应该具有与主核相同的染色强度。
3. 用药剂或非HCEC细胞处理形成的微核的选择性消耗显示在图2中。
  
  图2.微核的选定快照微核，其在未处理的（A）中形成并且由环丙沙星（B）和CIPAG（环丙沙星与银（I）的共轭物（C），HCEC细胞）处理;箭头表示HCEC细胞中的微核。线条相当于100μm。
Allium cepa 测定
1. 为了评估微观指数（MI）的微观参数的细胞分裂率，细胞周期中的分裂细胞数（前期，后期，中期，末期）与细胞总数有关。通过每个浓度计数1,800个细胞（每个载玻片300个细胞，总共六个载玻片，每个洋葱3个载玻片）分析所有类别。可以确定试剂的细胞毒性水平。在MI。
2. 在细胞分裂的不同阶段（前期，中期，后期和末期）观察到染色体畸变（CA）。可以观察到CA为染色体桥和断裂，染色体缺失，延迟，粘附，多极性和C-中期。
3. 核异常（NA）可以在子细胞中观察到与主核相似的结构，但是尺寸减小（分叶核，携带核芽，核细胞，微小细胞的细胞核）。
4. 微核（MN）也可以在子细胞中观察到类似的结构，但是对于主核的尺寸减小。
5. 选择的 Allium cepa 分生细胞的图标，其中正常的前期，后期，中期，末期，染色体畸变，核异常和微核如图3-5所示。
  
  图3. Allium cepa 分生组织细胞的正常阶段。 A.正常前期（P），正常中期（M），正常后期（A）可在中观察到在 Allium cepa 分生细胞中可观察到正常前期（P），正常中期（M）和正常末期（T）。线条与2.5μm。
  
  图4.暴露于化学试剂的 Allium cepa 分生细胞中观察到的染色体畸变。染色体缺失和后期桥接（A），C-中期（B），染色体粘附中期（C），中期染色体缺失（D），末期染色体桥（E）。线条相当于2.5μm。
  
  图5.在暴露于化学试剂的 Allium cepa 分生细胞中观察到核异常和微核。同步核芽前期（A），具有核芽的间期细胞核和前期微核（B），间期和正常中期微核细胞（M）（C）。线条相当于2.5μm。

致谢

微核试验的方案是根据之前的研究进行调整和修改的（Matsushima et al。等，1999; Sohaebuddin和Tang，2013）。在Banti 等中对其进行了描述。，2016; Sainis et al。，2016; Banti et al。。，2018; Chrysouli et al。。，2018a和2018b; > et al。，2018; Milionis et al。。，2018; Polychronis et al。，2019; Banti et al。，2019。
Allium cepa 测定的方案是根据之前的研究（Fiskesjó，1988，Fiskesjó，1993和Fiskesjó，1994）进行调整和修改的。（Sainis et al。< ，2018a和2018b; Milionis et al。，2018; Stathopoulou et al。。，2018）
＆nbsp;该研究由欧盟和希腊国家基金通过运营计划竞争力，企业家精神和创新共同资助，名为RESEARCH-CREATE-INNOVATE（项目代码：T1EDK-02990）。

竞争利益

作者声明没有利益冲突或竞争利益。

参考

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