材料和试剂

脾切除动物研究
1. 硅胶管（Patterson Scientific，每种油管使用各种不同颜色，适合麻醉剂蒸发器（Patterson Scientific，目录号：78703584）
2. Balb / C雌性小鼠（Jackson Lab，Bar Harbor，ME）（详见下文）
  获得重量为20-25g（8周龄）的Balb / C雌性小鼠用于实验。在整个研究过程中，小鼠没有病原体并保持过滤器分离。他们被安置在CHOC儿童医院研究所的认可动物护理设施中，并按照常规温度和实验室饲料和水进行常规光周期，均符合标准指南。
3. 过滤器（Animal Care Systems Inc.，Centennial，Colorado，目录号：C79037B）设置，推荐使用Anesthetic Vaporizer（Patterson Scientific，目录号：78703584）＆nbsp;
4. 实验室食物（Animal Care Systems Inc.，Centennial，Colorado，目录号：T.2919）和水
操作材料
1. 可吸收缝线（涂层VICRYL * Plus，抗菌与Irgacare MP * Polyglactin 910缝线，未染色编织，Ethicon Inc.）（Ethicon | J＆amp; J Medical Devices，Johnson＆amp; Johnson，Somerville，NJ）
2. 氯胺酮/甲苯噻嗪（剂量：120 / 20mg / kg）：氯胺酮（Ketaset，Fort Dodge Animal Health，Fort Dodge，IA），甲苯噻嗪（Anased，Akorn，Decatur，IL）
3. 可待因（1 mg / kg）：PubChem SID：378149847，Purchasable Chemical：C-006_CERILLIAN，（Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO，United States，63103）
4. PBS [磷酸盐缓冲盐水（1x），6.7 mM（PO 4 ），不含钙或镁]（Lonza，目录号：17-516F）
5. 5％FCS（Atlanta Biologicals，Flowery Branch，GA）
6. Betadine溶液，碘溶液：Betadine ®来自Purdue Products，LP（Stamford，CT）（在术前皮肤准备步骤之间应用异丙醇）
7. ChloraPrep TM 和DuraPrep TM 溶液（3M Health Care，St.Paul，MN）
8. 汉克斯平衡盐溶液（HBSS）（赛默飞世尔科技，目录号：14025092）
9. 异氟烷（Piramal Critical Care Inc.，Bethlehem，PA）
  注意：我们是直接从兽医处获得的。

设备

剪刀（精细科学工具，目录号：11058-11）
Precisa Bj-2100d精密实验室天平2,100 g x 0.1 g（数字分析电子天平实验室实验室精密秤）（Precisa Gravimetrics AG，CH-8953 Dietikon，瑞士）
手术刀，手术刀（Bard-Parker，目录号：372611）
绕口令：不锈钢AISI-420（岩石硬度48-58）
1. Wire Twister，Neurosurgery，Sternal Wire Twister Needr Holder 18 cm孔钳TC金手术缝合线）（World Precision Instruments，Sarasota，FL）
2. 重要的WEBSTER针头支架（BD V. Mueller，产品目录号：RH2561）
氧气罐
平滑钳（精细科学工具，目录号：11000-13）＆nbsp;
麻醉蒸发器（Patterson Scientific，目录号：78703584）
鼻锥，麻醉机（Patterson Scientific，目录号：78914722）＆nbsp;
干棉花涂抹器（Q tip）：无菌棉尖头涂抹器（Thomas Scientific，Waltham，MA，目录号：1213Q15，出厂编号：25-806 10WC）
带有高温的电笔（工厂编号：AA03X; Tiger目录号：TM77563）（Bovie ®医用眼科）（Symmetry Surgical，Antioch，TN）
加热灯（Fisher Scientific，Thomas Scientific，Waltham，MA，目录号：NC9631062）
感应室（Patterson Scientific，目录号：78917833）
便携式麻醉机（PAM）（Patterson Scientific，目录号：78914722）

程序

麻醉用于脾切除术
1. 麻醉准备和脾脏切除充分麻醉的确定。
2. 准备足够量的异氟醚。放入蒸发器的液体腔室（Anesthetics Vaporizer，Patterson Scientific，由麻醉技师操作，见视频1.）
  
  视频1.用于小鼠脾切除术的精确技术。该视频是根据CHOC儿童动物保护研究所的指导原则在CHOC儿童研究所制作的，并由CHOC儿童研究所动物研究伦理委员会根据IACUC协议＃_160501批准。
麻醉程序
1. 将硅管连接到诱导室（红色进入诱导室，紫色通向诱导室）。将长紫色线连接到建筑物的真空系统。
2. 打开废液泵，将氧气歧管连接到氧气罐。
3. 打开氧气罐，打开氧气流量计。将氧气流速和5％异氟烷的流速设定为0.9 L / s。打开流动软管到感应室。
4. 将小鼠放入诱导室。观察鼠标开始深呼吸。当呼吸速率降至每分钟60次以下时，鼠标充分麻醉。＆nbsp;
脾切除术程序
1. 准备手术
  所有手术工具都应在适合工具性质的手术之间进行消毒。手术器械安装在无菌手术台上，并配有无菌用品，如缝合线，不可吸收的缝合线，镊子，手术刀，捻线机，剪刀。将麻醉的小鼠放在桌子上，鼻子包在鼻锥内，提供吸入气体用于麻醉。用碘溶液（ChloraPrep TM 和DuraPrep TM 溶液）对皮肤进行灭菌。
2. 切口皮肤
  使用细剪刀在xyphoid过程正下方的垂直中线腹部制作0.5cm的皮肤切口。中线筋膜很容易在皮肤切口下识别，剪刀可用于切割相同长度的中线切口。
  注意：小心不要进入xyphoid软骨或任何更高的软骨进入胸腔，这将导致气胸和鼠标死亡。
3. 动员脾脏
  通过使用光滑的镊子和棉签涂抹器将网膜拉出来，将脾脏从左上象限带到中线切口。
4. 去除脾脏以与胃分离
  用光滑的镊子保持脾脏，并利用带有加热尖端的眼烧灼将附件和血管烧灼到肺门。通常，处理脾脏和分开血管的这部分可能是创伤性的，并且当由未经训练或没有经验的个体进行时导致显着的失血。这些简单技术中的一些的目的是限制动物的创伤和压力，这是避免显着改变炎症和免疫反应的显着全身反应的关键因素。使用脾血管保留技术（Kim et al。，2019）用烧灼笔烧灼附着血管至关重要。
5. 用4-0 vicryl缝合线封闭中线筋膜缺损，并使用Wire Twister for Neurosurgery用间断的4-0 Vicryl缝合线闭合皮肤。五针用于闭合0.5厘米长的皮肤开口。（正是外科医生指定了患者手术的结节类型，即手术绑带技术，显示了一个简单的方结与镊子绑在一起，如视频剪辑所示）。
6. 将小鼠麻醉持续约5-10分钟的程序，并将小鼠保持在加热灯下以避免体温过低。另外，皮下给予1cc盐水以在手术期间替换一些不可察觉的流体损失。
注意：步骤C2-C5应在10分钟内完成。
脾切除后恢复
1. 在手术后观察小鼠数分钟以确保足够的镇痛，并且在手术当天每小时再次观察4小时。动物外观，活动和行为（例如，食物和水摄入量）被密切监测，作为疼痛和不适的指示。如果动物出现疼痛，则使用止痛药（可待因，buprenex，羟考酮，吗啡，氢吗啡酮，即时注射），如通过视觉观察所证明的（抽搐运动，缺乏运动，显着的体重减轻，发声和缺乏梳理，听觉观察嘶嘶声30分钟，并在术后4小时再次观察。
2. 如果需要，可靠性在手术后的第一天每天给予两次。术后支持护理：手术后在笼底上确保适当的食物和水。伤口缝线随着时间的推移而被吸收。使用镇痛剂，镇静剂或神经肌肉阻滞剂和麻醉后恢复剂：氯胺酮/甲苯噻嗪（剂量：120 / 20mg / kg）或可待因（1mg / kg）。

数据分析

代表性成果：
外科脾切除涉及来自外科医生的训练和专业知识的许多变量，其直接关联于手术技术与手术的长度和手术的简易性。实际手术时间从熟练的外科医生到两名受训者不等，如图1所示。实际手术时间和相关并发症影响恢复时间，如5.4分钟所示（手术后运行，参见视频1的结尾），到2-3小时。完全恢复通常需要一周左右。具体地，熟练的外科医生在5.32-10.54分钟的范围内平均花费7.98分钟，10只小鼠（总共10只小鼠）存活至42-63天（处死）。受训者1在11.49-18.12分钟内平均11.49分钟，6只小鼠（共6只）存活2-14天;受训者2分20.43分钟，范围18.54-22.36分钟，3只小鼠（共3只）存活1-5天（图1）。

图1.生存与手术时间的关系

讨论：
我们描述了脾切除术的逐步技术，重点是通过限制手术的长度和熟悉小鼠解剖学以及一些限制创伤和因此失血风险的技术来进行快速简便的手术。该技术通过限制时间和专注于避免创伤性操作来最小化流体和血液流失。此外，手术切口的长度限制了所经历的疼痛，并且较短的手术持续时间意味着较少暴露于麻醉剂，这也可能影响生理反应。在所执行的过程中存在许多变化，因此，所测量的响应可能是高度可变的和不准确的。当手术迅速进行并且没有创伤时，它限制了手术和麻醉的不利影响，使得来自身体的应激反应对炎症和感染的影响不太显着。所有这些都可以解释为什么存活与外科手术持续时间的关系（图1）。我们研究了两种菌株（BalbC和C57BL / 6），两种菌株均有效。我们没有对雄性小鼠起作用，我们发现理想情况下，小鼠的年龄是八周。提示和技巧以及关键步骤包括：（1）切口位置在脾脏上方，（2）精确切割（最小切口大小足以拉出脾脏）; （3）避免撞击血管，（4）尽快密封血管，避免血液流失。（5）尽快密封切口，避免体液流失。下面引用的文献支持我们的观察。
＆NBSP;脾脏是体内最大的淋巴器官之一。它含有免疫细胞，包括抗原呈递细胞，B和T淋巴细胞。许多研究已经证明了脾脏在增加细胞和体液免疫反应中的重要性。脾切除的Balb / C小鼠具有降低的IL-4和IL-10的表达，使得它们更容易受到感染（Maioli 等人，，2007）。当脾切除时，已经认识到人类对某些革兰氏阴性生物敏感。自1952年King和Schumacker地标报告以来，他们面临着脾切除术后感染（OPSI）的风险。脾脏的丢失导致由于B淋巴细胞的特定亚群的丧失而对某些细菌和抗原产生适当的体液反应的能力降低。（包括血浆B细胞，记忆B细胞和滤泡B细胞），但也有可能减少细胞介导的免疫力，因为有特定的辅助T细胞（TH1和TH2）在监视中穿梭服务并拥有脾脏归巢受体。 T细胞包括细胞毒性T细胞，记忆T细胞，辅助T细胞，天然杀伤T细胞，抑制性T细胞和γδT细胞，天然杀伤细胞和祖细胞淋巴细胞干细胞。此外，脾脏的实际物理结构允许大量的血液进入血窦内，暴露常驻细胞以监测和应对潜在的抗原。
＆NBSP;脾细胞和特定部分可用于癌症中的免疫疗法（Li和Kabeer，2013）及其在肿瘤微环境中的反应（Li和Kabeer，2018）。可以收获自体脾脏淋巴细胞用于再灌注以保持针对癌症的特异性记忆T细胞应答，尤其是当与癌症基因组诊断相结合时（Li 等人，2014）。最佳腹腔镜脾切除术治疗免疫性血小板减少症的长期结果在109例患者的队列研究中得到了治愈，因为它与无复发率和长期反应的预测因素有关（Tastaldi et al。，2019）。微创手术可改善脾脏血管保留，减少手术并发症，15个相关队列记录了769例患者（Nakata et al。，2018）。病理性扩大（脾肿大）导致骨髓室外细胞增殖扩张，即，髓外造血（EMH）（Mo 等。，2009），还没有完全明白。需要将T细胞和B细胞募集到中枢（胸腺）和外周（脾和淋巴结）的恢复中。由于T细胞区室对于病原体和肿瘤抗原的最佳适应性免疫应答是必需的，因此需要阐明对脾脏切除术的免疫应答的综合评估，以实现针对癌症的全球免疫（Li et al。，2018）和感染。特别是，最近的一项研究表明，“一种用于癌症疫苗的新型抗原递送平台，通过PEG化脂质体（PL）系统将封装的Ag递送到脾边缘区B（MZ-B）细胞，显示出作为一种治疗方式的前景。用于征服肿瘤生长和/或进展“（Shimizu et al。，2018）。用于癌症疫苗的这种抗原递送平台依赖于对脾脏的对照手术的质量。此外，自体脾淋巴细胞分离用于保留个体对革兰氏阴性细菌的体液反应，并且可能对脾切除患者的疫苗接种具有更强烈的反应，这对患者可能具有显着的益处。
＆NBSP;总之，我们想要强调脾脏切除术的精确程序在脾脏相关研究中是必不可少的。我们注意到先前发布的程序（Reeves et al。，2001）与我们的程序不同。具体来说，（1）他们做了皮肤切口，长约2.5厘米，位于最后一根肋骨与髋关节之间的中间位置，而我们使用细剪刀在垂直中线腹部正下方仅用0.5厘米的切口进行切开。（2）他们没有密封血管，随着手术出血，恢复时间长达60分钟。请注意，我们使用烧灼笔密封血管和结缔组织以避免持续伤口 - 自然愈合需要更长的时间，小鼠只需要5分钟即可恢复。（3）将2.5厘米切口的两针（即，受感染）与我们的五针缝合0.5厘米切口进行比较。（4）成人脾切除术后其存活率为95％，相比之下，我们的外科医生获得了100％的存活率。

结论：
这种用于脾切除术的精确技术限制了小鼠应激反应，以便进行准确和真实的测量，以研究炎症和免疫力。

致谢

作者贡献：SCL和MHK构思了研究并起草了手稿，所有其他作者都参与了手稿的实验。所有作者都阅读并批准了最终的手稿。
我们感谢Brent A. Dethlefs和医学博士Maria Minon的热情和支持。
披露：资金来源：这项工作部分由国立卫生研究院（NCI，R01CA164509; NIEHS，R01ES021801-04S1），CHOC儿童基金会，CHOC-UCI联合研究奖（2014年，2015年，2016年）和CHOC儿童医师的研究试点资助。

利益争夺

作者声明他们没有竞争利益冲突。

伦理

所有方案均由批准所述实验的特定伦理委员会（IACUC）批准。 IACUC＃160501是本协议中动物实验的批准ID，有效期为2016年6月1日至2019年3月25日。

参考

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