材料和试剂

24孔组织培养板（目录号：BF-TCP011024）
35毫米组织培养板（目录号：TCD010035）
100毫米组织培养皿（目录号：JBF-TCD010100）
玻璃盖玻片12mmØ（Marienfeld，目录号0111520）
MDBK细胞（ATCC，目录号：CCL-22）＆nbsp;
MDBK-GFP细胞
注意：稳定表达GFP的MDBK细胞是通过在CMV启动子控制下携带携带GFP转基因的慢病毒转导而产生的。在我们的手中，MDBK细胞的转导效率约为5-10％，并且通过荧光激活细胞分选富集了GFP表达细胞（Merwaiss 等。， 2019）。
ncpBVDV / mCherry-E2（使用之前在Merwaiss et al。，2019中描述的反向遗传系统产生）
Dulbecco的高葡萄糖改良Eagle培养基（DMEM）（Gibco，目录号：12800082）
胎牛血清（PAA，目录号：A15-101）
马血清热灭活，新西兰血统（Gibco，目录号：26050088）
青霉素，链霉素（10,000 U / ml）（Gibco，目录号：15140122）
DPBS（Gibco，目录号：21600069）
胰蛋白酶-EDTA 10x（Gibco，目录号：15400-054）
DAPI（Molecular Probes，目录号：D1306）
FluoroGuard抗褪色试剂（Bio-Rad，目录号：170-3140）
小鼠抗BVDV E2单克隆抗体（DMAB28412; Creative Diagnostics）
小鼠抗BVDV E2多克隆血清和总IgG分数（Merwaiss et al。，2019）
PBS中多聚甲醛[PFA，（Sigma，目录号：158127）]的4％溶液（CSH Protocols，2006）
完全中等（见食谱）
感染介质（见食谱）

设备

37°C，5％CO 2 细胞培养箱（Thermo Scientific Form Series II Water Jacketed，型号：3131）
尼康Eclipse 80i荧光显微镜配备DS-Qi1Mc相机

软件

斐济（Schindelin et al。，2012）

程序

用非致细胞病变（ncp）BVDV / mCherry-E2感染MDBK细胞并建立持续感染的细胞
1. 每3至4天将MDBK细胞维持在1:10的完全培养基中。
2. 用胰蛋白酶提起细胞并在35-mm组织培养板中接种3×10 5个细胞。为了提起细胞，用PBS洗涤单层，加入0.3ml 0.05％胰蛋白酶/ 0.02％EDTA，37℃孵育3-5分钟，加入1ml完全培养基，上下移液提升细胞。＆nbsp;
3. 让细胞在37℃，5％CO 2 细胞培养箱中生长过夜。＆nbsp;
4. 在1 ml感染培养基中稀释ncpBVDV / mCherry-E2。
  注意：从ncpBVDV / mCherry-E2 RNA转染到MDBK细胞中回收病毒原种。通常，我们在转染后3-4天检查mCherry的表达，并通过报废收获细胞和上清液。在三次冻融循环后，通过以500×g离心澄清细胞裂解物，并将含有病毒原液的上清液等分并储存在-80℃。为了建立持续感染ncp病毒的细胞，我们在感染培养基中制备1：5稀释的原液。 Spinoculation（参见补充方案程序A）可用于促进感染。持续感染细胞的建立与感染的多样性无关，因为细胞被传代直至在80-100％的细胞单层中检测到感染。
5. 将1ml病毒接种物加入MDBK细胞培养物中，并在37℃，5％CO 2 细胞培养箱中孵育2小时以允许进入。
6. 取出接种物，加入2毫升完全培养基。
7. 在37℃下在5％CO 2 细胞培养箱中孵育直至细胞达到100％汇合（通常2-3天）。
8. 用胰蛋白酶将细胞提起并将板放入100mm组织培养皿中。＆nbsp;
9. 每3-4天分裂细胞，并通过在倒置荧光显微镜下直接观察平板评分mCherry的表达来检查感染细胞的比例。通常在传代2或3次后，80-100％的细胞应为mCherry表达阳性。
持续感染细胞和MDBK-GFP细胞的共培养（Merwaiss et al。，2019）
1. 用胰蛋白酶提起细胞并计数。
  注意：在此步骤中，细胞清洗和胰蛋白酶处理可去除任何感染性细胞外病毒。
2. 将完全培养基中持续感染的和GFP细胞以1：4的比例组合，最终密度为2×10 5个/ ml细胞/ ml，并加入适当稀释度的病毒中和抗体。准备细胞悬液，不要中和抗体用于对照。
  注意：用于扩散测定的病毒中和抗体的稀释度在经典的病毒中和测定中确定（Merwaiss 等，2019）。我们通常使用高于50％中和剂量的10倍来完全阻断无细胞病毒的传播。特别地，我们在我们的测定中使用1：1000稀释的商业小鼠抗BVDV E2单克隆抗体，1：500稀释的小鼠抗BVDV E2多克隆血清和1：100稀释的总IgG级分。
3. 将12毫升玻璃盖玻片上的500μl细胞混合物（每孔约10 5 细胞）加入24孔板中，使感染在5％CO 2中进行3天细胞培养箱。
  注意：感染后3天，在病毒中和抗体存在下培养的共培养物上清液中没有回收游离感染病毒，如通过重新感染新鲜单层MDBK细胞所测试的。 < br />
  
  图1.使用持续感染的生产细胞评估细胞间传播的实验装置的示意图。持续感染ncpBVDV / mCherry-E2（红色）的生产细胞与非共培养表达GFP的感染靶细胞（绿色）。从生产细胞向靶细胞的扩散通过GFP和mCherry（黄色）的表达得到明确评分。
可视化BVDV细胞间扩散
1. 用PBS洗涤细胞一次，并通过在PBS中加入400μl4％PFA进行固定。在室温下孵育15-20分钟。
2. 取出PFA溶液，用PBS洗涤两次。
3. 为了染色细胞核，在PBS中加入300μl1：1,000稀释的DAPI并孵育10分钟。
4. 用PBS洗涤两次并在一滴Fluoroguard抗褪色剂上安装在载玻片上。
5. 空气干燥载玻片并在荧光显微镜下捕获图像。
评估靶细胞中宿主因子的需求
该方案可用于通过使用稳定表达参与病毒附着和内化的蛋白质的显性失活形式的GFP融合的靶MDBK细胞来测试宿主因子对细胞 - 细胞传递的需求。例如，我们在研究中产生表达与GFP融合的显性阴性Eps15的MDBK细胞，以评估对于BVDV扩散到靶细胞中网格蛋白介导的内吞作用的依赖性（Merwaiss 等，，2019）。可以使用此设置评估功能突变的真正丧失的因素，例如Caveolin，Dynamin，Rab5和Rab7。该方案还与耗尽宿主因子的靶细胞相容。

补充方案：使用细胞病变BVDV / mCherry-E2定量细胞间扩散

材料和试剂

与主要方案中的相同，具有以下添加：使用如前所述的反向遗传系统产生的cpBVDV / mCherry-E2（Merwaiss 等人，，2019）。

设备

与主要方案相同，增加了以下内容：Thermo Scientific SL 16台式离心机，配有M-20微孔板摆动桶式转子。

软件

与主议定书中的相同。

程序

细胞病变BVDV感染MDBK细胞
1. 在24孔板中的500μl完全培养基中，在12mm玻璃盖玻片上每孔接种3×10 4个细胞，并允许在5％CO 2 细胞培养物中生长过夜。培养箱＆NBSP;
2. 在第二天，在感染培养基中制备cpBVDV / mCherry-E2至10 5 TCID 50 / ml的稀释液。
3. 洗净细胞，每孔加入200μl病毒稀释液。
4. 通过在500μM离心平板10分钟离心细胞。
5. 将板在5％CO 2 细胞培养箱中移至37℃，保持4小时。在这个阶段，没有必要用新鲜培养基替换含有感染培养基的病毒。
与MDBK-GFP细胞共培养
1. 用胰蛋白酶提取MDBK-GFP细胞并计数。
2. 以2×10 5个/ ml细胞/ ml的密度制备完全培养基中的细胞悬浮液，并加入适当稀释的病毒中和抗体。保持1ml悬浮液，不含中和抗体用于对照。
3. 彻底地，用PBS洗涤感染的细胞，并在每孔的粘附的感染细胞顶部铺板500μl的MDBK-GFP细胞悬浮液。
4. 在37°C，5％CO 2 细胞培养箱中孵育两天。
  注意：由于与非致细胞病变生物型相比，BVDV的细胞病变生物型的复制动力学更快，因此在感染后2天评估细胞扩散。通常，在使用cpBVDV的测定中，在细胞单层中观察到延长的细胞病变效应。
5. 按照主要方案中程序C的描述进行固定和DAPI染色。
  
  图2.用于评估cpBVDV细胞间传播的实验装置的示意图。为了建立共培养物，生产细胞首先被cpBVDV / mCherry-E2（红色）感染将表达GFP（绿色）的下一个未感染的靶细胞接种到感染的细胞单层上。＆nbsp;

数据分析

我们从三个独立的实验中生成数据。对于每个实验，我们使用20x物镜拍摄10张图像。＆nbsp;
使用执行以下步骤的脚本为斐济的每个图像评分：
1. 手动设置红色通道的阈值。
  注意：适当的阈值设置对于获得可靠的结果至关重要。针对每个通道调整阈值，并且我们在实验中使用相同的阈值。在对3-4个随机图像进行目视检查以确定误报之后，确定对一组图像使用的阈值的适合性。假阳性细胞（未感染的靶细胞）不应超过给定图像中双阳性细胞的10％。非扩散表型通常是一种极好的控制，可以测试阈值设置是否足够。对于非扩散表型，我们允许最多3％的双阳性细胞（假阳性）。例如，在我们的研究中，细胞间传递完全阻断非易感CRIB细胞或存在可溶性BVDV E2包膜蛋白。
2. 创建一个面具。
3. 用Dilate工具处理掩模（Process＆gt; Binary＆gt; Dilate，iterations = 5，counts = 3）。
4. 将面具保存为“mCherry”。
5. 手动设置绿色通道的阈值。
6. 创建一个面具。
7. 将掩码保存为“GFP”。
8. 手动设置蓝色通道的阈值。
9. 创建一个面具。
10. 使用Watershed工具处理掩模（Process＆gt; Binary＆gt; Watershed）。
11. 将掩码保存为“DAPI”。
12. 使用逻辑运算符（处理＆gt;图像计算器）使用mCherry和DAPI掩模作为源图像，为mCherry阳性细胞的细胞核生成新的掩模。
13. 使用Analyze Particles工具计算mCherry阳性细胞（Analyze＆gt; Analyze Particles，size = 50-infinity）。
14. 使用逻辑运算符（处理＆gt;图像计算器）使用GFP和DAPI掩模作为源图像，为GFP阳性细胞的细胞核生成新的掩模。
15. 使用Analyze Particles工具计数GFP阳性细胞（Analyze＆gt; Analyze Particles，size = 50-infinity）。
16. 使用逻辑运算符（过程＆gt;图像计算器）使用GFP核和mCherry核掩模作为源图像生成感染的GFP阳性细胞的结果掩模。
17. 使用分析粒子工具计数感染的GFP阳性细胞（分析＆gt;分析粒子，大小= 50-无穷大）。＆nbsp;
18. 计算传播百分比为（＃感染的GFP阳性细胞）/（#GFP阳性细胞）。＆nbsp;
我们通常在一次实验中计算8到10张图像中每种情况的总数为1,000个GFP阳性靶细胞（参见附录）。
计算每个实验的平均扩散百分比，结果表示为三次独立实验的平均值和标准差。

图3. BVDV扩散的自动图像分析。 A. BVDV从持续感染表达mCherry的报告病毒的细胞扩散到表达GFP的靶细胞的代表性图像。 B-d。逐步图像分析。 B.左，灰度图像的mCherry（红色），GFP（绿色）和DAPI（蓝色）通道。对，图像分割。 C.使用在图B和逻辑运算符中生成的掩模对mCherry和GFP阳性细胞进行编号。 D.从供体到靶细胞的扩散编号。 E.覆盖结果掩码（感染的目标单元格，黄色），在A和拆分通道中合并图像。底部，关闭顶行的盒装区域。比例尺=20μm。

食谱

完整媒体
DMEM
100单位/ ml青霉素和100 mg / ml链霉素
10％胎牛血清
感染媒介
DMEM
100单位/ ml青霉素和100 mg / ml链霉素
2％马血清

致谢

MariaJoséPascual协助生产针对E2的免疫血清。这项工作得到了国家科学和技术促进局（ANPCyT）资助（PICT2014-2213）给D.E.A.

利益争夺

作者声明没有财务或非财务竞争利益。

参考

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