材料和试剂

显微镜载玻片（Sail品牌，目录号：7105）
显微镜盖玻片（Fisher品牌，目录号：12-540-A）
Magnaporthe oryzae的菌丝＆nbsp;
微米。 oryzae Guy11，用作亲本野生型菌株。（ MoARK1 基因敲除突变体Δ Moark1 在我们以前的工作中获得。所有菌株都在完全培养基[CM]琼脂平板上培养。液体CM培养基用于准备菌丝体用于胞吞作用测定。菌株Guy11储存在我们的实验室中。）
N-（3-三乙基铵丙基）-4-（pdiethyl-aminophenyl-hexatrienyl）吡啶鎓二溴化物FM4-64（Invitrogen，目录号：T13320）
Latrunculin B（Cayman，目录号：10010631）
双蒸H 2 O（ddH 2 O）
DMSO（Sigma，目录号：D2650）
D-葡萄糖（西格玛，目录号：47829）
蛋白胨（Sangon biotech，目录号：A505247）
酵母提取物（Oxoid，目录号：LP0021）
酪蛋白氨基酸（Sangon biotech，目录号：A603060）
生物素（Sigma，目录号：B4501）
吡哆醇（Sigma，目录号：P9755）
硫胺素（Sangon biotech，目录号：A600939）
核黄素（Sangon biotech，目录号：A600470）
对氨基苯甲酸（Amresco，目录号：0779）
烟酸（西格玛，目录号：72309）
液体完全培养基（液体CM培养基）（见食谱）
维生素溶液（见食谱）

设备

Eppendorf微量移液管（1,000μl，100μl，10μl）
共聚焦荧光显微镜（蔡司LSM710,63x油）

程序

在28℃下在固体CM培养基上培养野生型菌株Guy11和Δ Moark1 4天。将琼脂培养物切成1mm×1mm的正方形，并将方块在液体CM中再培养2天。
制备FM4-64的储备溶液（1.3mg / ml，在DMSO中）并在蒸馏的H 2 O中以5μg/ ml的终浓度稀释，将该染色溶液保持在冰上。
用蒸馏水清洗菌丝，用载玻片上的FM4-64染色，将约20μl工作溶液滴在菌丝上，在室温下染色2分钟。＆nbsp;
在观察之前，用ddH 2 O洗涤菌丝。
在共聚焦荧光显微镜下（63x油，570 / 620nm激发，590nm二向色，630 / 630nm发射用于观察FM4-64的荧光）在暴露于FM4-64后拍照。用FM4-64染色2分钟后质膜和内部细胞膜组分的代表性图片如图1所示。

的图。 1 M中的胞吞作用测定。 A.野生型菌株Guy11和Δ Moark1 在液体CM中生长48小时，然后加入FM4-64并在共聚焦下拍摄照片暴露于FM4-64 2分钟后的荧光显微镜（Zeiss LSM710,63x油）。条=10μm。 B.相对荧光密度的计算。误差条表示SD，双星号表示统计学上显着的差异（**， P <0.01）。
制备Latrunculin B（Lat B）在DMSO中的浓度为25mg / ml的储备溶液，并在蒸馏的H 2 O中稀释，终浓度为0.1μg/ ml。 Lat B用作肌动蛋白聚合抑制剂来破坏内吞作用（Kaksonen et al。，2003）。
对于Lat B染色，在加入FM4-64之前，在步骤1中培养30分钟，用Lat B预处理菌丝。
重复步骤2-5。

数据分析

对于胞吞作用缺陷分析，在用FM4-64染料染色之前，在显微镜载玻片上覆盖菌株Guy11和Guy11背景中的基因敲除突变体2天，覆盖完全培养基（CM）并在FM4-后不同时间拍照暴露64，并且信号出现在Guy11中的质膜和内膜隔室上，但是在突变细胞染色后20-30分钟没有发生或延迟（Li et al。，2017）。每个结果至少呈现三次重复测量。在SPSS 2.0中使用SD和单因素方差分析（ANOVA）统计评估治疗之间差异的显着性（ https ：//spss.en.softonic.com/ ，芝加哥，IL，美国）。使用ANOVA对两种特定不同处理的数据进行统计学比较，然后如果ANOVA结果在 P <1时显着，则进行F检验。 0.05或 P ＆lt; 0.01。

食谱

液体CM培养基
10克D-葡萄糖
2克蛋白胨
1克酵母提取物
1克酪蛋白氨酸
1毫升维生素溶液
在121°C下进行湿热高压灭菌20分钟。
维生素溶液
0.01克生物素
0.01克吡哆醇
0.01克硫胺素
0.01克核黄素
0.01克对氨基苯甲酸
0.01克烟酸
将ddH 2 O加入100 ml并储存在4°C的深色玻璃瓶中

致谢

该研究得到了中央大学基础研究基金（拨款号KYT201805）和江苏大学创新团队计划（2017）的支持。

利益争夺

没有利益冲突或竞争利益。

参考

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