材料和试剂

1.5毫升微管（BIO-BIK，目录号：CF-0150）
0.6毫升微管（Thermo Fisher Scientific，目录号：502-GRD-Q）
2.0毫升微管（Watson，目录号：132-620C）
10毫升玻璃锥形管（EMKS-16.5，Nichiden-Rika Glass，目录号：113111）
毛细管玻璃管（内径0.69 mm，外径1.19 mm，长度90 mm，Drummond Scientific Company，目录号：3-000-210-G）
0.2-μm过滤器（关东化学，目录号：96923-00）
玻璃幻灯片
BD Lo-Dose U-100胰岛素注射器（29针针，Nippon Becton Dickinson，目录号：326666）＆nbsp;
棉毛（大崎医疗，目录号：100006）
玻璃微量移液器
一个。将毛细管玻璃管连接到玻璃微量移液器上，然后用仪器加热。
湾根据产品规程拉动毛细管玻璃管，准备玻璃微量移液管。
C。使用前用镊子将吸管从距尖端约1 mm处制动。
雄性c57BL / 6J小鼠（10-25周龄）
戊巴比妥钠盐（Nacalai Tesque，目录号：26427-14）
石蜡（徕卡，目录号：39601095）
液氮＆nbsp;
瞬干胶（Aron Alpha A，Daiichi-Sankyo）
LPS O111：B4（LPS，Sigma-Aldrich，目录号：L4130）
甲酸（Wako Pure Chemical Industries，目录号：063-05895）
乙腈（Wako Pure Chemical Industries，目录号：015-08633）
乙酸乙酯（Wako Pure Chemical Industries，目录号：058-00361）
乙醇（Wako Pure Chemical Industries，目录号：054-00461）
二甲苯（Wako Pure Chemical Industries，目录号：244-00081）
Mayer的苏木精溶液（武藤纯化学品，目录号：30001）
1％曙红Y溶液（武藤纯化学品，目录号：32001）
多聚甲醛（PFA，Wako Pure Chemical Industries，目录号：162-16065）
牙科水泥（Fuji I，GC，目录号：219AFB2X00208000）
木工胶（小西，目录号：10122）
二丁基羟基甲苯（BHT，Wako Pure Chemical Industries，目录号：047-29451）
PGE 2 （Cayman Chemicals，目录号：14010）
d 4 -PGE 2 （Cayman Chemicals，目录号：314010）
甘油（Nacalai Tesque，目录号：17045-65）
KCl（Wako Pure Chemical Industries，目录号：163-03545）
MgSO 4 （Nacalai Tesque，目录号：210-32）
NaH 2 PO 4 （Wako Pure Chemical Industries，目录号：197-09705）
Na 2 HPO 4 ·12H 2 O（Kanto Chemical，目录号：37240-00）
CaCl 2 （关东化学，目录号：07057-00）
NaCl（Wako Pure Chemical Industries，目录号：191-01665）
HCl（5 N，Wako Pure Chemical Industries，目录号：081-05435）
NaOH溶液（5N，Wako Pure Chemical Industries，目录号：196-05375）
戊巴比妥溶液（见食谱）
10％甘油溶液（见食谱）
Krebs-Ringer磷酸盐缓冲液（KRPB，见食谱）
0.5-M磷酸盐缓冲液（PB，见食谱）
4％PFA溶液（见食谱）

设备

移液器（Nichipet EXII，Nichiryo，目录号：00-NPX2-20,00-NPX2-200,00-NPX2-1000）
剪刀（Natsume Seisakusho，目录号：B-12H）
镊子（Y-277，平泽，目录号：9523）
牙钻
1. 电源（Minitor，目录号：C2012）
2. Rotary（Minitor，目录号：M112）
3. 金刚石棒（直径0.8 mm，Minitor，目录号：AD1403）
-80°C深冷冻柜（CLN-50U，Nihon Freezer）
微量注射泵CMA / 102（CMA Microdialysis AB，目录号：CMA / 102）
Microsyringe（Ito Seisakusho，目录号：MS-GAN100）
立体定位仪（Narishige，目录号：SR-5M-HT）
锚固螺钉（Eicom，目录号：AN-3）
CMA7导管（CMA Microdialysis AB，目录号：CMA P0000137）
CMA7微透析探针（1 mm膜长，CMA Microdialysis AB，目录号：CMA P000082）
自由移动装置（Eicom，目录号：TSU-25）
亚克力保持架（Eicom，目录号：FC-25）
超声波超声波仪（QSonica，目录号：XL2000）
玻璃微量移液器拉拔器（Narishige，目录号：PC-10）
固相柱（Oasis ® MAX 3 cc（60 mg）萃取柱，Waters，目录号186000367）
LCMS8050（岛津）
LC-30AD（岛津）
分析柱（Capcell Pak C18 IF2,2.1 mm内径x 100 mm，2μm，Shiseido资料，产品目录号：92887）
台式离心机（CF15RXII，日立）
Savant SpeedVac SPD2010（赛默飞世尔科技，目录号：SPD2010A-220）

软件

LabSolution LCMS（Shimadzu）

程序

第一部分：样本集

通过微透析方法从下丘脑区域收集组织间液
1. 使用胰岛素注射器（29号针头×12.7mm，0.5-ml），以50mg / kg体重的剂量将戊巴比妥溶液腹膜内给予c57BL / 6J小鼠（雄性，10-25周龄）。将鼠标的头部略微向地面倾斜，将针头插入腹部的右下象限，并将针头的1/2长度置于腹腔内。小心避免注射肠道器官和膀胱。
2. 在垂直平面上将导管插入立体定位仪器的操纵器（图1）。
  
  图1.在立体定位仪器上安装导管。 A.从Narishige获得的立体定位仪器SR-5M-HT。 B.引导插管连接到仪器操纵器的尖端。
3. 在麻醉下，将耳棒连接到鼠标上，使其水平保持水平。
4. 在手术前，用生理盐水彻底润湿小鼠头部，以避免毛发粘在剪刀上并扰乱手术。或者，您可以剃除头皮，但以下操作不需要这样做。
5. 使用直径最大3毫米的圆形剪刀去除前囟头周围的头皮，使头骨变得可见。
6. 用镊子和剪刀小心地去除覆盖头骨的骨膜和腱膜，直到胶片消失。
7. 用棉绒擦拭头骨，让表面干燥约10分钟。
8. 当表面潮湿时，前囟很难看到。在前囟出现之前，使用牙科钻在外露颅骨的后部形成直径约1mm的孔，以附接固定螺钉以固定引导插管。螺钉应安装在导管的附近，以便固定。＆nbsp;
9. 移动机械手就像引导插管的尖端越过前囟（图2），然后记录立体定位仪器的垂直和水平刻度标记。
  
  图2.将引导插管的尖端设置在颅骨的前室上。照片代表前囟上引导插管的尖端。
10. 将引导插管的尖端从前囟门向前移动0.9 mm，向右移动0.1 mm，并用油性墨水标记位置。要在该位置钻孔，需要拆下导管;因此，建议在移除套管之前，使用油性墨水标记位置组。
11. 使用牙科钻在标记点处形成直径约1 mm的孔。
12. 向下移动插管，将其触及大脑表面（在硬脑膜的水平），并读取深度的比例。
13. 将套管进一步缓慢向下移动到离表面4.0毫米的深度。此操作通常至少需要1分钟。在手术区域出血时，用脱脂棉擦去血液。如果出血没有停止，请将棉花留在血液流出的地方直至停止。如果小鼠出血超过十分之一的全血，通常估计为体重的1/13，则应考虑停止手术。
14. 用瞬间粘合剂将插管固定在头骨上。
15. 当本发明的粘合剂硬化时，使用牙科粘固剂来密封引导插管和颅骨之间的间隙。
16. 设置水泥后，将套管从机械手上拆下。
17. 使用精密螺丝刀，将固定螺钉安装到步骤A8中制作的孔中。
18. 用牙科粘合剂将颅骨和固定螺钉牢固地涂上，然后用固定螺钉固定插管。请确保导管不能移动;当鼠标自由移动时，它可能会脱落或移动，导致测量不准确。
19. 一旦水泥干燥，使用木工胶覆盖水泥表面。水泥和胶水通常需要大约10分钟和5分钟才能硬化。
20. 当胶水硬化后，将鼠标释放到其笼子中。
21. 第二天，用戊巴比妥麻醉小鼠并用镊子拔下插入导管内的假探针。
22. 插入新的微透析探针，并用牙科粘固剂固定。插入前，请按照制造商的说明冲洗探头。在我们的情况下，将探针的尖端浸入70％EtOH溶液中并以10μl/ min的流速注入KRPB 5分钟。然后，将探针的尖端转移到KRPB中并以相同的流速再灌注KRPB 5分钟。通常在使用当天准备探针。
23. 将小鼠放入笼中5天，以恢复术后损伤。如果小鼠在手术后体重减轻25％或更多，则不推荐实验，因为大脑严重受损。
24. 将鼠标连接到自由移动的设备上，将其转移到丙烯酸笼中，并以2μl/ min的流速注入KRPB。应每隔一小时在保存在冰上的0.6毫升微管中收集透析液样品（视频1）。
  
  视频1.从自由活动的老鼠身上收集透析液。在KRPB输注期间，小鼠可以在丙烯酸笼中自由移动。 KRPB从蓝色管流出，透析液样品从无色管中收集。（该视频是在金泽大学根据金泽大学动物保护协会的指导方针制作的，并由金泽大学动物研究伦理委员会根据协议＃AP-143148，AP-153511，AP-163750批准。）
25. 在开始输注后2小时，使用胰岛素注射器向小鼠腹膜内施用LPS（100μg/ kg体）。
26. 给药后6小时，通过颈椎脱位使小鼠安乐死，并分离脑。将大脑在4°C下在4％PFA溶液中固定过夜。
27. 收集探针，将其浸入10 ng / ml PGE 2 / KRPB溶液中，并以2μl/ min的流速在37°C下注入KRPB 1小时。将收集的透析液样品保存在-30°C直至使用。我们证实透析液中的PGE 2 通过在-30℃下储存至少一周而相对稳定。
28. 将用4％PFA固定的脑组织嵌入石蜡中，并制备附着在载玻片上的脑切片。
29. 为了从切片中除去石蜡，将它们在新鲜的二甲苯中浸泡在玻璃容器中4分钟，并重复该步骤4次。
30. 将切片浸入无水EtOH中，然后浸入95％，90％，80％和70％EtOH溶液各4分钟，以从中除去二甲苯。
31. 用苏木精染色细胞核1分钟。＆nbsp;
32. 用自来水洗涤5分钟后，观察细胞质，用曙红对切片染色40秒。用自来水冲洗掉额外的曙红，将载玻片浸入80％溶液中，然后用95％EtOH和无水乙醇浸泡10秒，使其脱水。
33. 将它们浸入新鲜二甲苯中3分钟，重复此过程三次，然后使用安装剂和盖玻片密封切片。
34. 使用立体显微镜确认探头在大脑中的插入位置（图3）。苏木精和伊红（HE）染色可以很容易地观察到探针插入的位置。
  
  图3.微透析实验后小鼠脑内的HE染色。微透析探针插入后显示小鼠脑冠状切片的组织学图像。箭头表示插入的微透析探针边缘的位置。指示的条形代表1,000μm。
下丘脑组织的集合
1. 对小鼠腹膜内施用LPS（100μg/ kg体）。
2. 在指定的时间段，通过颈椎脱位使小鼠安乐死。
3. 立即斩断小鼠，切开头皮，避免损伤大脑，暴露头骨，然后隔离整个大脑。可以在散布在冰上的薄纸上进行解剖。
4. 将大脑腹侧朝上放在冰上的玻璃板上，使其保持相对冷。
5. 通过在视交叉前面和乳头体后面的冠状切口解剖间脑。通过视网膜中间的另一个冠状切口（从嘴侧到漏斗部）移除弓状核。有关详细步骤，请参阅上一篇文章（Salehi et al。，2012）。
6. 沿着前连合处切割获得的脑块，并在1.5ml微管中收集前连合的腹侧作为下丘脑组织。＆nbsp;
7. 立即在液氮中冷冻下丘脑组织，并储存在-80°C深的冰箱中直至使用。冷冻样品可以储存至少一周，PGE 2 相对稳定。
CSF的收集
注意：CSF是根据之前报道的方法收集的（Liu et al。，2012）。
1. 将LPS（100μg/ kg体）腹膜内给予小鼠。
2. 在指定的时间段，用戊巴比妥麻醉小鼠（ i.p. 给药，50mg / kg体内）。
3. 在麻醉下，将鼠标头固定在立体定位仪器上，颈部尽可能向前倾斜。小心不要过度弯曲颈部。更多信息见上一份报告（Liu et al。，2012）。
4. 用剪刀剪掉并去除枕骨区域的皮肤，用镊子将硬脑膜区域的硬脑膜暴露。
5. 将玻璃微量移液管水平连接到立体定位仪器的操纵器上。
6. 将微量移液管的尖端插入硬脑膜中约1 mm的深度，然后将CSF吸入微量移液管中。收集的CSF的体积应约为10μl。
7. 将收集的CSF转移至1.5ml微管。
8. 立即在液氮中冷冻CSF，并储存在-80°C深度冷冻柜中直至使用。冷冻样品可以储存至少一周，PGE 2 相对稳定。

第二部分：PGE 2 提取

间质液（示意图如图4所示）
1. 将100μl透析液样品转移至1.5 ml微量管中，加入200μl1.25ng / ml d 4 -PGE 2 （作为内标）和15μl 10％甲酸水溶液（v / v）。通过添加85μl去离子水将d 4 -PGE 2 的终浓度设定为0.635ng / ml。当样品用流动相设定为50μl时，0.635ng / ml的浓度对应于5ng / ml，其足够高，不受每日测量波动的影响。
2. 加入500μl乙酸乙酯，剧烈振荡15分钟。
3. 通过台式离心机在4℃下以21,000 x g 旋转样品10分钟。
4. 将上清液转移到新鲜的1.5ml微量管中，并用Savant SpeedVac SPD2010在室温下减压蒸发上清液至干燥30分钟。
5. 用50μl含有0.075％甲酸（v / v）的25％乙腈溶液重构所得残留物，并通过摇动至少10分钟尽可能多地溶解它们。
6. 通过在4℃下以21,000 x g离心10分钟将未溶解的材料或碎片分离，然后获得澄清的上清液。
7. 将上清液应用于LC-MS / MS以确定PGE 2 的C isf 。
图4. PGE的示意图 2 从透析液中提取
下丘脑组织（示意图如图5所示）
1. 准备一块下丘脑组织，在1.5毫升微量管中称重约10毫克。然后，加入200μlPBS，200μl10％甘油溶液，5μl10mg / ml BHT溶液和10μl100ng / ml d 4 -PGE 2 < / sub>溶液（最终浓度为2.4ng / ml）。将组织均化，并用超声波超声波仪剪切脱氧核糖核苷酸10秒。
2. 将匀浆转移到10-ml玻璃锥形管中，并加入2.485ml 25％乙腈溶液（v / v）。剧烈摇晃5分钟。
3. 在固相柱（Oasis ® MAX柱柱）中加入3 ml绝对乙腈，用2.5 ml注射器的柱塞加压，然后通过色谱柱。
4. 向筒中加入3ml 25％乙腈水溶液（v / v），并通过柱。
5. 将3ml制备的匀浆加入到柱中，并通过柱。
6. 向筒中加入3ml 25％乙腈水溶液（v / v），并通过柱。
7. 向滤筒中加入3 ml绝对乙腈，然后通过色谱柱。
8. 加入1.3ml 1％甲酸乙腈溶液（v / v），并将洗脱液收集到2.0ml微量管中。
9. 使用Savant SpeedVac SPD2010在室温下在减压下蒸发洗脱液1小时。
10. 加入50μl含有0.075％甲酸（v / v）的25％乙腈水溶液，摇动10分钟。
11. 用台式离心机将上清液在21,000 x ＆lt; em＆gt; 4℃下分离10分钟。
12. 将上清液应用于LC-MS / MS以测量PGE 2 的C hyp 。
图5.从下丘脑组织中提取PGE 2 的示意图
CSF
1. 加入200μlPBS，200μl10％甘油水溶液，5μl10mg / ml BHT和10μl100ng / ml d 4 -PGE 2 将水溶液（最终浓度为2.4ng / ml）加入含有5μlCSF的10ml玻璃锥形管中。
2. 加入2.58ml 25％乙腈溶液（v / v），剧烈振荡混合5分钟。
3. 后续程序如下丘脑组织所述（见程序B）。

第III部分：PGE 2 通过LC-MS / MS定量分析

通过LC-MS / MS测量经过萃取程序的样品。测量条件如下所示。 PGE 2 和PGD 2 的分子量相同，但它们可以在下述条件下分离用于LC-MS / MS分析（图6）。

分析柱：Capcell Pak C18 IF2（内径2.1 mm x 100 mm，2μm）
流动阶段：
1. 水相：0.1％甲酸/水（v / v）
2. 有机相：乙腈
（b）浓度的梯度：
0-9分钟：15-50％
9-10分钟：50-90％
10-11分钟：90％
11-12分钟：90-15％
12-13分钟：15％＆nbsp;
流速：0.4毫升/分钟
注射量：30μl
Q1，Q3：设定质荷比（m / z）以确定PGE 2 和PGE 2 -d 4 。对于PGE 2 ，Q1和Q3分别设置为351.00和271.35，对于PGE 2 -d 4 分别设置为355.00和275.25。

图6.本协议中PGE 2 和PGD 2 的色谱图。 PGE 2 和PGD 在相同的m / z Q1（351.00）和Q3（271.35）处检测到2 。分别在7.6和8.0分钟的保留时间检测到PGE 2 和PGD 2 。

数据分析

计算小鼠下丘脑中间质PGE 2 浓度：
微透析法中PGE 2 浓度的体外回收率（RR）通过以下等式计算：

其中， C d，体外和 C r 表示PGE 2 浓度透析液样品和PGE 2 浓度分别溶解在KRPB中。 C isf 通过除以从小鼠收集的透析液样品中的PGE 2 的浓度来估算（ C d，vivo

笔记

请参阅原始出版物 http://www.jneurosci.org/content/38/24 / 5584 有关本协议预期结果的示例。

食谱

戊巴比妥溶液（6.48 mg / ml）
1. 称取64.8mg戊巴比妥钠，并将其溶于生理盐水中
2. 加入灭菌的生理盐水至10毫升
3. 在阴凉处将溶液储存在室温下
10％甘油溶液（v / v）
将100μl甘油与900μl去离子水混合，并将溶液储存在室温下
Krebs-Ringer磷酸盐缓冲液（KRPB，总体积100ml; pH7.4）
1. 称取700.8,17.9,14.4,10.8,50.1和13.3mg NaCl粉末（终浓度为120mM），KCl（2.4mM），MgSO 4 （1.2mM），NaH 2 PO 4 （0.9 mM），Na 2 HPO 4 ·12H 2 O（分别为1.4mM）和CaCl 2（（1.2mM）
2. 将粉末溶解在去离子水中
3. 用5N HCl调节pH至7.4
4. 用水加至100毫升
5. 使用0.2-μm过滤器过滤溶液以对其进行灭菌
6. 将溶液储存在室温下直至使用
0.5 M PB（pH 7.4）
1. 称取6g NaH 2 PO 4 粉末，并将其溶于100ml去离子水（0.5M）中
2. 称取53.7g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O粉末，并将其溶于300ml去离子水（0.5M）中
3. 通过向0.5M Na 2 HPO 4 中添加0.5M NaH 2 PO 4 溶液将pH调节至7.4。
4. 将溶液储存在室温下
4％PFA溶液（w / v，总体积200 ml）
1. 用微波炉煮沸150毫升去离子水
2. 加入120μl5NNaOH
3. 加入8克PFA粉末
4. 溶解PFA后，加入40毫升0.5M PB
5. 用去离子水填充至200毫升
6. 将溶液储存在4°C直至使用

致谢

这项工作得到了日本科学促进会（No. 055）的科学研究资助（KAKENHI，15H04755和15K15181）的支持。所描述的部分实验也得到了日本科学促进会和吸烟研究基金会的支持[授予055至T.N.]。我们感谢Drs。 Teikyo大学的Okura和Deguchi就如何进行实验提出了各种建议和指示。

利益争夺

作者没有披露利益冲突。

伦理

所有动物实验均根据金泽大学机构动物护理和使用委员会（许可号AP-143148，AP-153511和AP-163750）的要求进行。

参考

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