材料和试剂

离心管15,50 ml（SARSTEDT，目录号：62.554.001,62.547.254）
1.5 ml反应管（SARSTEDT，目录号：72.706）
培养皿（SARSTEDT，目录号：83.3902）
移液器吸头10μl，20μl，200μl，1,000μl（SARSTEDT，目录号：70.1130,70.116,70.760.002,70.762）
血清移液器5 ml和10 ml（SARSTEDT，目录号：86.1253.001和86.1254.001）
Leucosep TM ，带有多孔屏障，50 ml，预填充Leucosep TM 分离介质（Greiner Bio-One GmbH，目录号：227288）
无菌过滤器0.2μm（SARSTEDT，目录号：83.1826.001）
细胞培养板，6孔，Cell +（SARSTEDT，目录号：83.3920.300）
0.4cm电穿孔小杯（Molecular BioProducts，Inc。，通过Thermo Fisher Scientific GmbH购买，目录号：5540-11）
FACS试管5 ml和0.5 ml（SARSTEDT，目录号：55.1579,55.673）
质粒-DNA溶液pEGFP-N1（Clontech，目录号：6085-1）和pDsRedExpress-N1（Clontech，目录号：632429），Qiagen EB缓冲液各900 ng /μl（储存温度较长时间：-80°C），否则保持在4°C）
人体静脉血，抗凝
KCl（Carl Roth，目录号：6781.3）
KH 2 PO 4 （Carl Roth，目录号：3904.2）
Na 2 HPO 4 ·12H 2 O（Carl Roth，目录号：N350.1）
NaCl（Carl Roth，目录号：3957.3）
S-Monovette ® K3 EDTA 4.9 ml和7.5 ml（SARSTEDT，目录号：04.1931.001和01.1605.001）
不含酚红的RPMI 1640（Life Technologies的Gibco ®，通过Fisher Scientific GmbH购买，目录号：11835-063，储存温度4°C）
胎牛血清（Life Technologies的Gibco ®，通过Fisher Scientific GmbH追踪，目录号：10270-106）
EB Buffer，QIAGEN Plasmid Plus Giga Kit的一部分（Qiagen GmbH，Hilden，目录号：12991）
具有表面活性剂的BD FACS护套溶液（BD Biosciences，目录号：336911）
1x PBS（见食谱）
0.9％NaCl溶液（见食谱）
PBMC培养基（见食谱）

设备

移液器，Eppendorf研究®加10μl，20μl，200μl，1,000μl（Eppendorf，目录号：3123000020,3123000039,3123000055,3123000063）
Stratalinker ® UV交联剂（Stratagene，目录号：400072，型号：Model 1800）
带旋转斗转子的离心机（Eppendorf，目录号：5805000010,5804709004）
Neubauer计数室改进（Carl Roth，目录号：PC72.1）
具有电容扩展器和脉冲控制器的Gene Pulser II（Bio-Rad Laboratories，Inc。，目录号：165-2106,165-2108,165-2110）
CO 2 培养箱Hera细胞150（Kendro Laboratory Products，目录号：51013568）
BD FACSCalibur流式细胞仪系统采用488 nm激光（Becton，Dickinson and Company）
-80°C冰箱HFU600TV（赛默飞世尔科技 TM ，目录号：11670823）

软件

CellQuest Pro（Becton，Dickinson and Company，版本4.0.2）
Prism（GraphPad Software，Inc。）

程序

第1天

准备质粒溶液
1. pDsRedExpress-N1：使用EB缓冲液将浓度调节至最大900 ng /μl。
  注意：质粒浓度越高，质粒在照射过程中越可能位于彼此之上，并且照射效果越差。这导致最终的DNA修复能力更高。通过将40μl的液滴吸移到培养皿（直径10cm）中照射一半体积。使用Stratalinker 紫外线，用5 kJ / m 2 UVC（254 nm）照射培养皿盖子交联剂。照射后，将液滴收集在1.5ml反应管中。另一半质粒溶液保持未照射。
2. pEGFP-N1不需要进一步处理，因为它可用作转染对照。质粒溶液的浓度应> 600 ng /μl以避免体积过大。 260nm和280nm处的吸光度比应为~1.8。
3. 对于DNA修复的测量，混合10μg的pEGFP-N1和30μg的经照射的pDsRedExpress-N1。为了计算校正因子，每次电穿孔混合10μg的pEGFP-N1和30μg的未照射的pDsRedExpress-N1。注意，所需的体积取决于质粒溶液的浓度。使用EB缓冲液将混合物的体积调节至100μl。为整个计划的研究准备足够的质粒-DNA混合物。将混合物储存在4°C下短期储存或在-80°C下储存较长时间。
根据制造商的说明，使用Leucosep TM 管从12 ml人血液中分离PBMC，如下所示：
1. 使用0.9％NaCl溶液（24ml终体积）以1：2稀释12ml抗凝血，并转移至Leucosep TM 管中。
2. 在摇摆式转子转子中以1,000 x g 离心10分钟并关闭制动器。图1A显示离心前的Leucosep TM 管，图1B显示离心后的管。
  
  图1.离心前后的Leucosep TM 管。 A. Leucosep TM 管充满抗凝血液，之前用1：2稀释0.9％NaCl溶液。 B.密度梯度离心后的Leucosep TM 管。从上到下可以清楚地看到不同的层：血浆，富集细胞，分离介质，多孔屏障，再次分离培养基，最后是红细胞和粒细胞。
3. 从顶部吸取约10ml血浆以更容易地到达富集的细胞部分。
4. 使用1,000μlEppendorf移液管收集富集的细胞级分，并将细胞转移到50ml离心管中。
5. 用10ml PBS洗涤细胞，并在250μL离心下离心10分钟。
6. 用5ml PBS重复洗涤步骤两次。当第二次加入5ml时，使用Neubauer计数室计数细胞。
对于每次电穿孔，将每孔3ml PBMC培养基填充到6孔细胞培养板中。
对于每次电穿孔，在15ml离心管中以250×10μg/ ml离心2×10 6个细胞10分钟。准备两个管子，以便能够正确计算一个样品的DNA修复能力。一个管将包含经照射的pDsRedExpress-N1和pEGFP-N1，另一个管包含未经照射的pDsRedExpress-N1和pEGFP-N1。在不含酚红的150μlRPMI培养基中重悬沉淀。
向细胞悬浮液中加入100μl先前制备的质粒混合物，使悬浮液含有10μgpEGFP-N1和30μgpDsRedExpress-N1（照射或未照射）。
将250μl细胞悬浮液转移至具有4mm间隙的电穿孔比色皿，将其置于Gene Pulser II的冲击室中，并在400V和500μF下开始电穿孔。
注意：始终一个接一个地对一个辐照批次和一个未辐照的批次进行电镀。这两个将用于计算一个样本的DNA修复能力。
将电穿孔顺序转移到含有RPMI培养基的制备的6孔细胞培养板中。
在37°C，5％CO 2 和95％的相对湿度下孵育24小时。

第2天

为每种电穿孔方法准备一个1.5 ml反应管。
使用1,000μlEppendorf移液管将细胞混合在细胞培养板的孔中，然后将1.5ml细胞悬浮液转移到先前制备的1.5ml反应管中。＆nbsp;
在250 x g 下离心10分钟。＆nbsp;
除去1.4ml上清液，在剩余的100μl中重悬细胞，并转移到0.5ml FACS管中。
将0.5ml管置于5ml管中，并使用488nm激光进行FACS分析。

数据分析

使用FACSCalibur，CellQuest Pro软件和488nm激光进行FACS分析。用对照样品进行目标细胞（淋巴细胞）的门控。为了分析含有经照射的pDsRedExpress-N1的样品，使用相同的门。转染的对照样品和含有经照射的pDsRedExpress-N1的样品的门控分别显示在图2和图3中。

图2.对照样品的FACS分析。 A.对照样品含有未经辐照的pDsRedExpress-N1和门控淋巴细胞。 B.用门R1门控的转染细胞。右下区域（R2）显示仅表达GFP的细胞，左上区域（R3）显示仅表达DsRed的细胞，右上区域（R4）显示表达GFP和DsRed的细胞。

图3.含有经辐照的pDsRedExpress-N1的样品的FACS分析。 A.含有经过门控的淋巴细胞的经照射的pDsRedExpress-N1的样品。 B.用门R1门控的转染细胞。右下区域（R2）显示仅表达GFP的细胞，左上区域（R3）显示仅表达DsRed的细胞，右上区域（R4）显示表达GFP和DsRed的细胞。

为了计算DNA修复能力，将表达GFP和DsRed的细胞的百分比加起来如下。所有表达GFP的细胞是门R2和R4中的细胞。所有表达DsRed的细胞是门R3和R4中的细胞。
＆NBSP;为了校正关于转染功效的修复能力，需要校正因子F. F总是根据对照样品的GFP和DsRed的百分比计算。因此，对于经辐照的pDsRedExpress-N1的每次转染，需要对照。 F是表达GFP的细胞与对照样品的表达DsRed的细胞的百分比之比。 DNA修复能力根据Matt 等人（2016）计算如下：

对于统计分析，可以使用任何版本的Prism（GraphPad Software，Inc。）。我们建议一式三份来计算DNA修复能力。

笔记

注意电穿孔过程中的时间常数。在我们的实验中，时间常数通常在20到25毫秒之间。此外，太高的时间常数导致低转染效率或细胞死亡。
为了让激光器预热，在FACS分析前大约30分钟打开流式细胞仪。
为了补偿488 nm激光对DsRed的非最佳激发，与GFP相比，DsRed的三倍用于电穿孔。＆nbsp;
我们建议每个样品一式三份（三种控制方法和三种含有辐照pDsRedExpress-N1的匹配方法）。

食谱

1x PBS
8克NaCl
0.20克KCl
2.88 g Na 2 HPO 4 ·12H 2 O
1.24克KH 2 PO 4
加入1L ddH 2 O，pH 7.4
0.9％NaCl溶液
9克NaCl
加入1L ddH 2 O，使用0.2μm无菌过滤器的无菌过滤溶液
PBMC媒体
RPMI 1640不含酚红
20％胎牛血清
储存在4°C

致谢

作者感谢医学博士。 Karin Rupprecht（中医中心 - TCM西格马林根）和医学博士。 Adrian Schulte（F. X. Mayr BodenseeCenterÜberlingen）用于抽取血液样本并通知志愿者。

利益争夺

其中一位作者与德国Bad Homburg的MSE Pharmazeutika GmbH签订了咨询合同。

伦理

所有实验均按照赫尔辛基宣言进行，并经德国LandesärztekammerBaden-Württemberg伦理委员会批准。在收集样本之前通知志愿者并且他们书面同意使用他们的血液样本。

参考

Athas，W.F.，Hedayati，M.A.，Matanoski，G.M.，Farmer，E.R。和Grossman，L。（1991）。开发和现场测试验证循环人淋巴细胞中DNA修复的分析。 Cancer Res 51（21）：5786-5793。
Burger，K.，Matt，K.，Kieser，N.，Gebhard，D。和Bergemann，J。（2010）。改良的荧光测定宿主细胞再激活试验，以确定原代角质形成细胞，黑素细胞和成纤维细胞的修复能力。< / a> BMC Biotechnol 10:46。
Matt，K.，Burger，K.，Gebhard，D。和Bergemann，J。（2016）。减少卡路里对人类外周血单核细胞DNA修复能力的影响。 Mech Aging Dev 154：24-29。
Mendez，P.，Taron，M.，Moran，T.，Fernandez，M。A.，Requena，G。和Rosell，R。（2011）。经过修改的宿主细胞再激活试验，用于量化冷冻保存的外周淋巴细胞中的DNA修复能力。 DNA Repair（Amst） 10（6）：603-610。
Nouspikel，T。（2009）。哺乳动物细胞中的DNA修复 - 核苷酸切除修复：多功能性的变异。 Cell Mol Life Sci 66（6）：994-1009。
Protić-Sabljić，M.，Whyte，D.，Fagan，J.，Howard，B.H.，Gorman，C.M.，Padmanabhan，R。和Kraemer，K.H。（1985）。对猿猴病毒40转化的干皮病色素细胞系中连锁克隆基因的表达进行定量。 Mol Cell Biol 5（7）：1685-1693。
Qiao，Y.W.，Spitz，M.R.，Guo，Z.Z.，Hadeyati，M.，Grossman，L.，Kraemer，K。H. and Wei，Q.Y。（2002）。使用荧光素酶报告基因通过改良的宿主细胞再激活试验快速评估紫外线DNA损伤的修复并且与正常人淋巴细胞中DNA修复基因的多态性相关。 Mutat Res 509（1-2）：165-174。
Roguev，A。和Russev，G。（2000）。用于DNA修复的双波长荧光检测。 Anal Biochem 287（2）：313-318。
Shrinivas，S.A.，Shanta，S.H.，Prajakta，B.B。（2017）。 DNA：人体的损伤和修复机制。 Glob J Pharmaceu Sci 3（2）：555613。