材料和试剂

移液器吸头（P20，P200，P1000）
接种循环
玻璃或一次性圆底无菌管，用于培养10 ml酵母培养物（Sarstedt，目录号：62.547.004）
管，50毫升（Sarstedt，目录号：62.547.004）
1毫升微细U100胰岛素注射器（BD，目录号：324827）
乳胶手套
白色念珠菌 wt分离物SC5314
小鼠6至8周龄白化雌性小鼠[B6（Cg）-Tyrc-2J / J;杰克逊实验室 - 美国]
PBS（Thermo Scientific，目录号：18912014）
异氟醚（Orion Pharma，Abbott Laboratories Ltd.，Great Britain，CAS：26675-46-7）
HypoxiSense 680荧光成像剂（PerkinElmer，NEV11070r）
酵母氮碱（Difco，目录号：233520）
硫酸铵（西格玛，目录号：31119）
酵母合成辍学培养基补充剂（Sigma，目录号：Y1501-20g）
葡萄糖（西格玛，目录号：47829）
含有2％葡萄糖的合成完全脱落培养基（SC培养基）（见食谱）
1x PBS（见食谱）

设备

移液器（P20，P200，P1000）
用于培养酵母培养物的30°C振荡器（速度约为180 rpm）（IKA KS 4000i）
离心机（Eppendorf，型号：5180 R）
细胞计数器Vi-CELL Cell Viability Analyzer Beckman Coulter
GI-8气体麻醉系统（Caliper Life Sciences，Inc。）
电动剪刀剃毛鼠（Moser Chromini）
加热灯
Xenogen IVIS活体动物成像系统（PerkinElmer）
孵化器（Binder KB 53）

软件

Living Image软件4.5（PerkinElmer）

程序

真菌生长和小鼠准备（第1-3天）
1. 启动 C.白色念珠菌液体培养物通过接种冷冻原种，在50ml管中用环进入10ml SC培养液中，并在30℃下以180rpm的速度振荡孵育20小时。
2. 取10μl C。从前一天的白色念珠菌培养物到50ml管中的10ml新鲜SC培养基中。将新混合物孵育相同的时间段。
3. 在第3天，对细胞计数器中的细胞进行计数，并在10ml SC培养基中制备新的传代培养物，其起始细胞数为5×10 7个细胞/ ml，并使其生长3小时。将真菌在3,000 x g 离心，在室温下离心10分钟，并重悬于1 ml 1x PBS中，并使用细胞计数器计数真菌细胞数。＆nbsp;
4. 将真菌浓度调节至5×10 8 细胞/ ml，如果不立即使用，则保持在冰上。计算实例：从8×10 8 细胞/ ml的原液悬浮液中制备1ml浓度为5×10 8 sup / ml细胞/ ml的酵母悬浮液，加入625将μl的原液悬浮液加入到375μlPBS中。
5. 在 C之前24小时，向所有小鼠腹膜内注射100μlHypoxiSense680染料（每只小鼠2nmol /100μlHypoxiSense染料）。白色念珠菌皮下感染。
皮下感染（第4天）
1. 将小鼠置于麻醉箱中，并在GI-8气体麻醉系统上将异氟醚气体的水平调节至2.5％。从麻醉箱中取出鼠标，将鼻子轻轻放入异氟烷输送锥内。
2. 将小鼠麻醉后，用毛发修剪器将毛皮从背侧剃掉（图1）。
3. 用两根手指将剃须区域拉到鼠标皮肤上。将注射器插入拉出的皮肤，用100μl C感染小鼠。制备白色念珠菌（5×10 7 细胞）。几分钟后，动物皮肤下方会出现一个小液体凸起。
4. 使用100μl1xPBS以类似方式处理和注射对照动物。
5. 应将动物放在加热灯下，直到它们完全清醒，以确保它们的健康。
  
  图1.如何进行皮下感染的示意图
生物荧光成像（第4-7天）
1. 使用2.5％异氟烷的气流麻醉麻醉箱中的小鼠，并将它们转移到IVIS成像仪的相机盒中。将鼠标朝下放入室内，每只动物的鼻子都放在提供异氟醚的锥体内。
2. 选择适合染料发射和激发波长的IVIS滤光片设置（675 ex / 720 em）。
3. 在初始感染后的第4天，使用防护装置防止邻近动物的信号出血，在两组中拍摄动物的零时间图像（图2）。暴露动物0.5秒暴露，捕获由HypoxiSense染料活性产生的体内生物荧光作为缺氧标记物。要对5只鼠标进行成像，请选择D视野。
4. 由于动物可能长时间处于麻醉状态，因此请确保将它们置于加热灯下，以防止动物过度冷却直至完全清醒。
  
  图2.实验程序的示意图。 d：Day。

数据分析

图像处理以量化平均落射荧光
1. 在对应于存在脓肿的区域的较高落射荧光区域上绘制感兴趣区域（ROI）。在黑暗区域放置额外的ROI以定义背景（图3）。
2. 进行ROI分析以测量每只动物的平均落射荧光。
3. 从每只动物获得的值中减去暗背景的落射荧光值。
4. 使用这些值创建图表，其中y-标度上的落射荧光值和x-标度中的动物组。使用双尾Mann-Whitney U检验进行感染组和对照组之间的统计学显着性。
  
  图3.生物荧光体内成像。具有缺氧区的小鼠的代表性IVIS成像，其在 C时发展。 albicans 感染。

笔记

这是一种非致命性感染，在7天后自行消退。真菌不会扩散到皮下组织之外，动物的健康状况也不会受到很大影响（视频1）。

视频1.皮下感染 C的小鼠。白蛋白接种后一天。该视频描绘了感染后第1天的小鼠。小鼠接受皮下注射 C.白色假丝酵母。动物的活动和健康只受到很小的影响。
动物与动物的变异性和动物的年龄可能会干扰结果。建议在计划实验时仔细选择动物组的大小。所描述的协议使用n>每组5只动物。
在终点，可以处死动物并切除脓肿以测量免疫细胞或真菌负荷的浸润。
动物始终保持在IVC系统笼中，随意饮水，并在设施护理人员每天在动物基础设施期间以及在感染期间由研究人员和负责的兽医监测。

食谱

SC介质（1升）
class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：350px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>酵母氮碱
3.4克
硫酸铵
10克
酵母合成辍学培养基补充剂
1.92克
葡萄糖
2％（w / v）
MQ水
1 L
之后高压灭菌
PBS 1x磷酸盐缓冲盐水（PBS）
将1片PBS溶解在500毫升MQ水中之后高压灭菌

致谢

我们感谢Roland Nordfelth对IVIS设备的帮助。这项研究的资金来自C.F.U.来自瑞典研究理事会VR-M 2014-02281和2017-01681以及Kempe Foundation SMK-1453。 J.P.L.的额外补助金来自J. C. Kempes Minnes Stipendiefond，Arneska Stiftelse和Helge ax：son Johnsons Stiftelse被承认。在Lopes 等人（2018）中简要描述了该方法。资助者在研究设计，数据收集和分析，决定发表或准备手稿方面没有任何作用。

利益争夺

所有作者都声明没有竞争利益。

伦理

动物实验根据瑞典农业委员会许可A79-14中所述的动物伦理指南进行。

参考

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