材料和试剂

透明胶带
PYREX ® 55 ml螺旋盖培养管，带PTFE衬里酚醛胶囊，25 x 150 mm（Corning Co. Ltd.，目录号：9826-25）
塑料转移移液管（透明LDPE，4 ml，薄柄，Thermo Fisher Scientific Co. Ltd.，目录号：13459118）
剃刀刀片（Hi-Stainless Single Edge Blade，FEATHER Safety Razor Co. Ltd.，目录号：FHS-10）
塑料培养皿（90 mm x 14.2 mm）（Thermo Fisher Scientific Co. Ltd.，目录号：5184E）
Kimtowel擦拭巾（Kimberly-Clark Co. Ltd.）
Kimwipe纸条（Kimberly-Clark有限公司， ca。 2 mm x ca。长10 mm）（图2）
2毫升微管（Eppendorf Co. Ltd.，目录号：0030120094）
铝箔
8周龄拟南芥（Arabidopsis thaliana）的花序茎
甲醇（日本Kishida Chemical Co. Ltd.，目录号：000-48666）
KH 2 PO 4 （Nakalai Co. Ltd. Japan，目录号：09582-75）
K 2 HPO 4 （Nakalai Co. Ltd. Japan，目录号：09583-65）
来自 Streptomyces griseus <（em）的链霉蛋白酶E（PE）（产品名称为“Actinase E”.Nacalai Co. Ltd. Japan，目录号：29003-51），储存于4°C
SDW：灭菌超纯水（例如，Milli-Q）
用于PE溶液的磷酸钾缓冲液（参见食谱）
PE解决方案（见食谱）

图2.使用夹具固定样品的Kimwipe纸条（ ca。 2 mm x 10 mm，手工制作）

设备

最大拉力试验机500牛顿（N）（T.S.E.Co. Ltd. Yokohama，日本，Auto Com系列，目录号：AC-500N-CM，图3A，见注1）＆nbsp;
称重传感器最大10 N（T.S.E. Co. Ltd.，目录号：TC-10N-B）（图3A）
上部和下部纤维夹具在杠杆作用下（图3B和3C，夹爪5N，A＆amp; D Co.Ltd。，东京，日本，目录号：J-TZM-5N）

图3.拉伸试验机及其夹具。 A.拉伸试验机最大500 N力。 B.带钩和固定夹的可拆卸夹具。在可移动夹具的此位置设置负载的零点。 C.顶部可拆卸和底部固定的光纤夹具。夹具可以通过杠杆作用打开，样品应用手拧紧。
烤箱（37°C或60°C，EYELA Co. Ltd.，日本，强制气流烘箱，WFO420）
水浴（TR-1α，ASONE Co. Ltd.，日本，目录号：1-5832-31）
化学通风柜
分析天平（Mettler Toledo Co. Ltd.，Balance XPR26，目录号：30355476）
通用防静电套件U型电极（Mettler Toledo Co. Ltd.，目录号：11107767）
Sharp-Pointed Dissecting Scissor（赛默飞世尔科技有限公司，产品目录号：08-940）
数码相机
标尺（最大150 mm）
Tweezer（EBL Co. Ltd.，型号：＃202）

软件

拉力试验机的操作和分析软件（T.S.E. Co. Ltd.，Yokohama，Japan，UTPS-STD Single for windows 10，英文版可用）
Microsoft Excel（ https://products.office.com/en-au/excel ）

程序

植物材料制备（收获组织后需要2-3天）＆nbsp;
1. 用剪刀从8周龄的拟南芥切下花序茎的基部（距茎的底部大约30mm）（图4A-4C），立即将整个部分外植体浸没在40ml中。 PYREX ®中的甲醇55 ml螺旋盖培养管。植物在16小时光照下（60-80μmolm -2 s -1 ）/ 8小时黑暗循环在恒定的23°C植物室中生长，没有湿度控制。
  注意：一个植物系的评估需要超过15个花序茎外植体（见注2）。
  
  图4.茎段取自拟南芥的花序茎的基部。 A.在土壤中生长的8周龄植物。用一把剪刀在红色箭头的位置切割基端。 B.收获的和新鲜的花序茎。切除的茎段应在箭头位置切割。应删除所有分支。 C.消化的新鲜花序茎段应立即浸入甲醇中。 D.在甲醇中煮沸后，30毫米长的花序茎段，再水化和链霉蛋白酶E.处理。每个样品的纵向和垂直长度应在稍后由Image J.确定。
2. 在步骤A3中描述的热处理过程中，紧紧关闭培养管盖以避免管中的甲醇爆炸。
3. 将含有外植体的Pyrex玻璃管浸入80℃的化学通风橱中的水浴中浸入甲醇中。孵育15分钟（见注3）。
4. 在室温下冷却管后，弃去绿色甲醇提取物并在玻璃管中加入40ml新鲜甲醇。＆nbsp;
5. 重复步骤A3和A4，直到外植体变白至少五次以上。
6. 用SDW洗涤甲醇固定的外植体超过5次以除去甲醇。
  注意：确保所有外植体都沉入SDW的底部。如果一些外植体漂浮在管中，则静置5分钟并再次更换SDW。
7. 使用塑料移液管将SDW完全丢弃在管中。
  注意：请勿用移液管接触组织外植体，以免损坏组织。
8. 加入40毫升Pronase E（PE）溶液（见食谱），在使用前于37℃预孵育2小时，放入玻璃管中。
  注意：预孵育对于去除PE产品中的糖基水解酶污染物至关重要。确保所有外植体都沉到PE溶液中50 ml玻璃管的底部。
9. 将含有外植体的玻璃管在带有盖紧盖子的PE溶液中在37°C的烘箱中孵育18小时（见注4）。
10. 从管中丢弃PE溶液。＆nbsp;
11. 用SDW洗涤PE处理的外植体三次以上，并用塑料移液管尽可能多地从50ml玻璃管中取出剩余的溶液。
  注意：请勿使用移液管接触组织外植体，以免组织破坏。
12. 用剃刀刀片修剪外植体的基端，使其长度正好为30毫米（图4D）。＆nbsp;
13. 确定花序外植体的力和位移曲线（程序B）或将30mm长的组织外植体在室温下储存在甲醇中直至使用。如果外植体储存在甲醇中，则在实验前用SDW洗涤外植体至少三次（程序B的步骤10）
确定花序外植体的力和位移曲线（大约 5分钟，用于测量一个样品）。
1. 打开拉伸试验机和计算机（图3A）
2. 根据制造商的手册，将操作软件中的“拉伸测试模式”和数据采样方法设置为X-T模式，最大分辨率为（0.001 mm）。
3. 将上夹具（无样品）设置到原始位置后，将上（上）和下（下）光纤夹具之间的初始距离设置为10 mm（图3B和6F）。＆nbsp;
4. 根据制造商的手册（图3B）校准称重传感器（10 N的0％和50％），而不拆下上部可拆卸夹具。
5. 将上部可动夹具的速度设定为2 mm / min。
6. 将最大负载设置为1 N（ ca。 100 g ），这是测试完成时的负载。
7. 设置程序以在测试后将上部可移动夹具返回到初始位置。
8. 指定数据文件格式并输入样品的工厂线名称和测试编号。
9. 在管架中制备含有2ml新鲜甲醇的2ml微量管。用透明胶带保护管标签（工厂管线名称和测试编号）免受甲醇的影响。
10. 如果样品在测试前已经储存在甲醇中，则将30 mm长度的外植体洗涤并再水化至少5次SDW变化。在再水化后，确保所有组织外植体都沉入玻璃管的底部。
11. 将组织外植体转移到来自玻璃管的含有40ml SDW的塑料培养皿中，并将它们保持在SDW中直至需要进行测试。
12. 从SDW取出组织外植体，立即用尺子拍摄组织外植体的照片，用数码相机拍摄测试编号和样品名称的标签（图4D）。稍后确定外植体的纵向和纵向长度。
  注意：避免从步骤B12到B24干燥样品。
13. 将组织外植体放在Kimtowel擦拭器上以除去外植体表面上的多余水分。
14. 将2 mm x ca。 10 mm的Kimwipe条带放在组织外植体的两端（图5A）。折叠中间的每个纸条以保持组织外植体的两个边缘（图5B）。
  注意：在测试过程中，这些纸条是防止纤维夹组织滑动所必需的。
  
  图5. Kimwipe的两个小纸条用于防止样品在夹具中滑动。 A.在样品下方放置两个纸条后，将中间的两个纸屑折叠到红色方向箭头。 B.之后，用上部和下部夹子固定样品的部分，用蓝色框表示。
15. 通过杠杆作用用可移除的夹具固定外植体（图5B）的纸带覆盖部分的一侧。确保组织的纵轴垂直位于上夹具的中心（图6A和6B）。
16. 拧紧上夹具的手拧螺丝，以更好地固定组织。不要完全拧紧螺钉以避免损坏组织（图3C）。确保顶部可拆卸夹具与样品无任何间隙（图6C中的上箭头）和任何变形（图6C中的下箭头和白色虚线）。在拉伸试验期间，间隙和变形可能引起力延伸曲线的轻微波动。如果发现间隙和变形，请用拇指推动夹具的附件来调整夹具和样品（图6D和6E）。在步骤B18和B19中，使用底部固定夹具固定样品也需要进行此调整。
  
  图6.将组织样品固定在两个夹具之间。 A.首先用上部可拆卸夹具固定样品（前视图）。查看样品一端的位置（箭头）。 B.确保样品与上夹具边缘之间的角度 ca。 90度（侧视图）。 C-即确保顶部可拆卸和底部固定的夹具适合样品，没有任何间隙（由C中的上箭头指示）和任何变形（由C中的下箭头和白色虚线表示）。 F和G.将上夹具上的样品悬挂在称重传感器的钩子上后，用下夹具固定样品。确保样品的上端和下端从夹子上突出一点（G中的箭头）。
17. 将上夹具与外植体悬挂在装载单元的钩子上。
18. 用下夹具固定外植体的纸带覆盖部分的另一侧（图6F）。确保组织的纵轴垂直位于下夹具的中心，与上夹具一样。样品的两端应从夹具中挤出一点（图6G中的箭头）。＆nbsp;
19. 拧紧下夹具的手拧螺丝，牢牢固定组织（图3C）。不要完全拧紧螺丝，以免损坏组织（见注5）。
20. 确保两个夹具之间的载荷几乎为0 N（从-0.042到0.0183 N，平均值和标准偏差：在我们的实验中为-0.0059 N±0.0092），以避免在测试前进行预拉伸。在估算刚度之前，强烈的预拉伸可能导致样品的塑性变形（Cleland，1967）。
21. 如果测试前的负载值不可忽略，请稍微松开下夹具的手拧螺丝。重复步骤B18和B19，使负载值接近0.或者，使用手动控制器将两个夹具之间的距离改为短于10 mm（图1A），使负载值接近零而不接触下夹具（ - 在我们的实验中0.01mm至0.05mm）。在后一种情况下，记录两个夹具之间改变的距离。
22. 通过抬起上夹具开始将样品加载到1N。
23. 达到1 N后，应机械停止加载，上夹具应立即返回初始位置（10 mm距离）。在此过程中准备下一个样品（从步骤B12开始）。
24. 在将上夹具和可动夹具返回其原始位置后，通过松开手拧螺丝和撬动动作，从上夹具和下夹具中取出测试样品。
25. 将每个测试样品在甲醇中储存在编号为2ml的微管中。
26. 对一个工厂生产线中的所有样品重复这些步骤（从步骤B12到步骤B25）。
27. 存储一个工厂生产线的所有数据系列，并以文本格式导出所有样品的位移（mm）和负载（N）之间的关系。应使用Microsoft Excel软件或等效软件分析文本数据文件（请参阅数据分析）。
28. 关闭拉力试验机和电脑。
测定样品干重
1. 用塑料转移移液管从含有组织外植体（存储在步骤B24中）的2ml微管中丢弃甲醇，避免破坏样品。
2. 将2毫升微量管置于60°C的烘箱中2天，不加盖，但使用一小块铝箔片以防止灰尘污染。＆nbsp;
3. 用配有防静电装置的分析天平和定制的防风罩（注6）称量干燥的测试样品。

数据分析

花序刚度的测定
1. 使用Microsoft Excel或同等软件打开在程序B的“步骤27”生成的文本数据文件。（我们实验中的文本数据文件示例以补充文本文件”Col0“。）
2. 突出显示包含数据的所有单元格在我们的数据中，第一列（A）包含位移值（mm），第二列（B）包含使用软件函数的单个拉伸测试和绘制散点图中的力（N）值。
3. 观察力和位移曲线（图7）。曲线应该有两个阶段。首先，位移伴随着负载的少量增加。这至少部分是由于当外植体固定在夹具之间时存在一些松弛，因此应该将其移除。超过某一点，随着位移的进行，负荷以线性方式增加（Cleland，1967）。使用线性范围中的力和位移值来计算刚度。
4. 绘制所有测试的曲线并以线性方式比较力范围以提取代表性线性范围。例如，我们估计在我们的实验中代表性的线性力范围在0.6到0.8N之间（图7）。
  
  图7. 拟南芥的不同植物系中花序外植体的力和位移曲线。 Col0：野生型， nst1nst3 ：<的双敲除突变体 NST1 和 NST3 基因（Mitsuda et al。，2007）， nst1nst3ERF35VP16 ： NST3 启动子驱动的 ERF035 基因，在双敲除突变体中具有VP16激活结构域（Sakamoto et al。，2018）。
5. 在固定力范围内（例如，从0.6到0.8 N）突出显示位移列和力柱的单元格，并创建散点图。
6. 使用软件功能添加线性拟合（直线拟合）。在Microsoft Excel中，单击图形区域内的任意位置，然后从“图表工具”中选择“布局”选项卡。单击“趋势线”图标，然后选择“线性趋势线”选项。
7. 要显示公式，请单击“趋势线”并选择“更多趋势线选项...”然后选中“在图表上显示公式”和“在图表上显示R平方值”框。（图8）。
8. 等式的斜率表示刚度（N / mm，注7）。在我们的实验中检查具有R平方值的线性图的适合度（R 2 ：0.9969比1）。
  
  图8.由Microsoft Excel准备的线性图和力（F）和位移（D）曲线的方程。圆形实际图表示0.6到0.8 N之间的值，用于线性适合。 “n”表示使用的图的数量。由红色框包围的等式中的斜率给出了每个样本的刚度。还表示了R平方值。
组织外植体的每单位长度质量的确定和引入或突变基因对花序茎刚度的影响的估计
1. 从程序B的步骤12（图4D）拍摄的照片确定组织外植体的纵向和纵向长度。
2. 将干重（在方法C的步骤3中获得）除以每个组织外植体的纵向长度，以获得每单位长度的质量。
3. 在图表上绘制每单位长度的质量和所研究的植物系的刚度，以查看是否存在任何趋势（即，基因对材料特性的影响，例如细胞壁组成和/或生物结构几何，如壁厚，图9）。
  
  图9.不同基因型植物的干重/长度和力/伸长（硬度）之间的散点图。野生型（n = 17个生物学独立样本）， nst1nst3 （ n = 27个生物学独立样本）和 nst1nst3 NST3pro :: ERF035-VP16 （n = 76个生物学独立样本）（Sakamoto et al。，2018）。
代表性数据
野生型拟南芥花序茎外植体的力和位移曲线的一组原始文本数据以补充文本文件。我们的实验的三个测试结果（图7和图8）也作为补充Excel文件（Force和displacement.xls）。有关每长度质量和刚度之间的关系图，请参见图9.

笔记

拉伸试验机AC-500N-CM之前从日本出口到新加坡和泰国等目的地。英语手册可用于使用计算机操作本机。其他拉伸试验机也可在您所在国家/地区的当地制造商处获得，例如Instron（ https://www.instron页面没有自动跳转/ EN-US ）。我们实验室中拉伸试验机的详细性能如表1所示。

表1.拉伸试验机AC-500N-CM的性能
我们在野生型中使用了17种植物，在 nst1nst3 突变体系中使用了27种植物，对于转基因 NST3 启动子驱动的4种独立系中的每一种使用了15至22种植物 ERF035-VP16 （以前的出版物中共120株植物）（Sakamoto et al。，2018）。
用甲醇热处理杀死花序茎并使内源细胞壁水解酶失活。然而，扩张蛋白，一种壁松动蛋白在这种治疗中仍然活跃（Cosgrove，2011）。如果需要观察外源施加的扩展蛋白或糖基水解酶对机械性质的体外效应，有一种方法可以在不使用甲醇的情况下从植物组织中去除原生质体（Cosgrove，2011）。在一些实验中推荐用于拉伸试验机中的纤维夹具的非金属材料（Cosgrove，2011）。如果获得机械性能的意外结果，则可能需要考虑组织的固定方法和夹具的适当材料。
Pronase E（Actinase E）是一种非特异性蛋白酶（Nomoto et al。，1960），通常用于从多糖样品中去除蛋白质（Schmidt et al。， 2014; Higashi et al。，2015）。该处理从外植体中去除剩余的细胞质蛋白和细胞壁蛋白，包括扩展蛋白。根据Cleland（1967）的观点，链霉蛋白酶处理从茎外植体中去除了85-90％的总蛋白，这是通过凯氏氮或脯氨酸测量的，但它对结肠壁蛋白如伸香蛋白的溶解效果较差;仅去除了45％的羟脯氨酸。＆nbsp;
如果手动螺钉拧紧不合适（太强或太弱），在装载样品时可能会发现样品滑动或破裂（图10）。

图10.样品滑动或破裂的示例。箭头表示样品滑移或破裂的位移。
在我们的实验中，花序外植体的干重（ ca. 30mm，纵向长度）范围为1.02至4.91mg。因此，我们需要一个配有防静电设备和定制防风罩的分析天平，以实现每个样品干重的稳定测量（图11）。

图11.使用定制防风罩和防静电设备的分析天平
通过使用每单位长度的质量作为横截面积的任意单位，所获得的等式也可用于计算组织的细胞壁顺应性（Cleland，1967）。细胞壁顺应性是杨氏模量的倒数。如果每个样品加载两次以获得第一和第二力延伸曲线，则可以从这两条曲线确定弹性延展性和塑性延展性的一致性（Masuda，1969; Cleland，1984; Park和Cosgrove，2012; Phyo 等。，2017）。

食谱

用于PE的磷酸钾缓冲剂
1. 将14.3 g KH 2 PO 4 和25.5 g K 2 HPO 4 溶解到SDW中，并将整个体积调整为500毫升，获得0.5 M磷酸钾缓冲液（pH 7.0）
2. 将缓冲液在121℃下高压灭菌15分钟
PE解决方案
1. PE粉瓶在使用前必须在室温下，以避免其吸湿
2. 将0.02g PE粉末溶于85ml SDW中
3. 加入5毫升乙醇和10毫升0.5M磷酸钾缓冲液
4. 制备的PE溶液应在37℃下孵育2小时以使可能污染的糖基水解酶失活
5. 孵育后，使用PE溶液从组织外植体中去除蛋白质

致谢

我们感谢T. Kuroki，S。Watanabe，Y。Ono（TS-engineering Co. Ltd.），A。Nabeshima（Soft-brain Co. Ltd.）和A. Tanaka（BLW Co. Ltd.）的技术支持拉力试验机。我们还要感谢A. Hosaka，Y。Sugimoto，H. Takasaki博士和M. Yamada对植物材料制备的技术支持。该协议是通过优化大阪市立大学名誉教授Yoshio Masuda博士（1928.01.01-2017.03.22）及其同事进行的拉伸试验程序而制定的。 K.Y.感谢Chikashi Shimoda博士和Masayuki Katsumi博士友好地提供Y. Masuda博士的信息。这项工作得到了JST ALCA计划（授权号JPMJAL1107）和JSPS KAKENHI拨款号JP18H02259对N.M.的支持。

利益争夺

作者宣称没有竞争利益。

参考

Burgert，I.，FrühmannK。，Keckes，J.，Fratzl，P。和Stanzl-Tschegg，S.E。（2003）。木纤维的微拉伸试验结合用于高效应变检测的视频扩展法。 Holzforschung 57（6）：661-664。
Cleland，R。E.（1967）。 Auxin和细胞壁的机械特性。 Ann NY Acad Sci 144（1）：3-18。
Cleland，R。E.（1984）。英斯特朗技术作为直接过去墙体可扩展性的衡量标准。 Planta 160（6）：514-520。
Cosgrove，D.J。（2011）。测量体外植物细胞壁生长的可扩展性。 Methods Mol Biol 715：291-303。
Higashi，K.，Okamoto，Y.，Mukuno，A.，Wakai，J.，Hosoyama，S.，Linhardt，R。J. and Toida，T。（2015）。含有3-O-磺基葡萄糖醛酸的 Enteroctopus dofleini 的硫酸软骨素功能酸残留物。 Carbohydr Polym 134：557-565。
Masuda，Y。（1969）。生长素诱导的细胞壁可扩展性扩增。植物细胞生理学 10（1）：1-9。
Masuda，Y。（1990）。生长素诱导的细胞伸长和细胞壁变化。 J Plant Res 103：345。
Mitsuda，N.，Iwase，A.，Yamamoto，H.，Yoshida，M.，Seki，M.，Shinozaki，K。和Ohme-Takagi，M。（2007）。 NAC转录因子，NST1和NST3，是木质组织中次生壁形成的关键调节因子。拟南芥。植物细胞 19（1）：270-280。
Nakata，M.T.，Takahara，M.，Sakamoto，S.，Yoshida，K。和Mitsuda，N。（2018）。拟南芥干振动的高通量分析，以识别机械改变的突变体属性。 Front Plant Sci 9：780。
尼克拉斯，K.J。和Moon，F。C.（1988）。来自葱属的花茎的弯曲刚度和弹性模量通过多个共振频谱测量来自 Allium sativum 的茎秆。 Am J Bot 75（10）：1517-25。
Nomoto，M.，Narahashi，Y。和Murakami，M。（1960）。 Streptomyces griseus的蛋白水解酶：VI。通过链霉菌griseus蛋白酶水解蛋白质。 J Biochem 48（4）：593-602。
Olson，A.C.，Bonner，J。和Morré，D.J。（1965）。对 Avena 胚芽鞘细胞壁的强制扩展分析。 Planta 66（2）：126-134。
Park，Y。B.和Cosgrove，D。J.（2012）。拟南芥木葡聚糖缺陷型xxt1 / xxt2突变体细胞壁生物力学特性的变化。植物生理学 158（1）：465-475。
Phyo，P.，Wang，T.，Kiemle，S.N.，O'Neill，H.，Pingali，S.V.，Hong，M。和Cosgrove，D.J。（2017）。沿着生长的花序茎的壁力学和多糖的梯度。植物生理学 175（4）：1593-1607。
Radotić，K.，Roduit，C.，Simonovic，J.，Hornitschek，P.，Fankhauser，C.，Mutavdzic，D.，Steinbach，G.，Dietler，G。和Kasas，S。（2012）。生活拟南芥细胞的原子力显微镜刚度层析成像揭示了其力学性质生长过程中表面和深层细胞壁层的结构。 Biophys J 103（3）：386-394。
Sakamoto，S.，Somssich，M.，Nakata，MT，Unda，F.，Atsuzawa，K.，Kaneko，Y.，Wang，T.，Bagman，AM，Gaudinier，A.，Yoshida，K.，Brady， SM，Mansfield，SD，Persson，S。和Mitsuda，N。（2018）。拟南芥完全取代具有原代细胞壁的次生细胞壁。 Nat Plants 4（10）：777-783。
Schmidt，E.P.，Li，G.，Li，L.，Fu，L.，Yang，Y.，Overdier，K.H.，Douglas，I.S。和Linhardt，R.J。（2014）。重症患者呼吸衰竭的循环糖胺聚糖特征。 J Biol Chem 289（12）：8194-8202。
Shah，D。U.，Reynolds，T。P. S.和Ramage，M。H.（2017）。植物的强度：测量茎的机械特性的理论和实验方法。 J Exp Bot 68（16）：4497-4516。
Strabala，T。J.和Macmillan，C。P.（2013）。拟南芥木材模型 - 花序茎的情况。 Plant Sci 210：193-205。
Taiz，L。（1984）。植物细胞扩增：细胞壁机械特性的调节。 Ann Rev Plant Physiol 35：585-657。