材料和试剂

移液器吸头
Eppendorf管
X光片
滤纸（Bio-Rad Laboratories，目录号：1703965）
ERK3蛋白：野生型或突变型ERK3蛋白可以从Sf9昆虫细胞，哺乳动物细胞或 E中纯化。大肠杆菌如前所述（Bian et al。，2016，Elkhadragy et al。，2018）
重组蛋白质底物：GST-SRC3-CID可如前所述进行纯化（Elkhadragy et al。，2018），髓磷脂碱性蛋白（MPB）可商购（Millipore Sigma，目录号：M1891）
[γ- 32 P] -ATP（Perkin Elmer，目录号：NEG002Z），储存于-20°C，半衰期为14.29天
ATP（非放射性，Thermo Fisher Scientific，目录号：PV3227）
磷酸酶抑制剂（Sigma-Aldrich，目录号：P0044）
氯化镁（MgCl 2 ，Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9530G）
二硫苏糖醇（DTT，Thermo Fisher Scientific，目录号：P2325）
乙二醇 - 双（β-氨基乙基醚）-N，N，N'，N'-四乙酸（EGTA，Boston BioProducts，目录号：BM-151）
InstantBlue Coomassie蛋白质染色剂（Expedeon，目录号：ISB1L），储存于4°C
十二烷基硫酸钠（SDS，Millipore Sigma，目录号：71725）
SDS聚丙烯酰胺凝胶（可以使用预制或手工凝胶）
Tris-HCl（赛默飞世尔科技，目录号：15567027）＆nbsp;
β-巯基乙醇（Millipore Sigma，目录号：M3148）
甘油（Millipore Sigma，目录号：G5516）
Bromophenol blue（Millipore Sigma，目录号：B3269）
10x激酶反应缓冲液（参见配方），以小等分试样储存于-20°C
4x SDS样品缓冲液（参见配方），以小等分试样储存于-20°C

设备

移液器
-80°C冰箱
立式微型凝胶电泳系统（如Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophoresis Cell，Bio-Rad，目录号：1658005）
电泳电源（如PowerPac Basic电源，Bio-Rad，目录号：1645050）
有机玻璃屏蔽和Perspex Eppendorf管支架
盖革计数器
加热块或水浴设置为30°C和95°C
台式离心机＆nbsp;
凝胶干燥器（如Bio-Rad凝胶干燥器型号583）
X光胶片处理器（如柯尼卡的一个，目录号：SRX101A）放在黑暗的房间里
X光胶片盒和安全袋
扫描仪

软件

ImageJ（美国国立卫生研究院和光学与计算仪器实验室，imagej.nih.gov/ij）

程序

通过在含有Mg 2+的激酶反应缓冲液中混合ERK3蛋白，纯化的底物，5μCi[γ- 32 P] -ATP和30μM非放射性ATP来进行该测定。每次反应可以使用从Sf9细胞或哺乳动物细胞纯化的50至100纳克ERK3蛋白。如果使用从细菌中纯化的ERK3蛋白，则必须使用更大量（500 ng-1μg）。最好使用不同量的激酶进行初始优化实验，以确定适合磷酸化底物的激酶浓度。 ERK3的催化失活（激酶死亡）突变体可以作为反应的阴性对照。此外，缺乏ERK3的反应将证实没有放射性同位素或共纯化激酶污染底物。对于所有酶测定，每个反应中使用的底物量必须过量，以使其不受速率限制。通常每次反应使用约0.5-2μg底物。
＆NBSP;在ATP存在下将ERK3与底物温育后，通过加入含有十二烷基硫酸钠（SDS）的样品缓冲液终止反应，然后煮沸。通过凝胶电泳分离反应组分。然后用考马斯蓝溶液染色凝胶，干燥并通过放射自显影观察（图1）。

图1.放射性体外 ERK3激酶测定的概述

该程序的步骤如下所述：

准备10x激酶反应缓冲液（在食谱中列出），并根据需要用去离子水稀释适当的体积至1x浓度。＆nbsp;
在1x反应缓冲液中稀释ERK3蛋白和每种纯化的底物，使得每次反应使用1μl。例如，如果在测定中使用100ng ERK3蛋白和1μgMBP，则使用1x反应缓冲液将ERK3稀释至100ng /μl，并将MBP稀释至1μg/μl。
注意：建议将纯化的蛋白质在-80°C下以小等分试样储存，以避免多次冻融。在进行实验之前，必须在冰上慢慢解冻。
通过在1x反应缓冲液中稀释原液ATP制备0.5mM非放射性ATP溶液。最好在实验时制备新鲜的稀释ATP，并避免反复冻融原浆ATP。
确定每种组分的体积，使总反应体积为30μl（表1）。每次反应添加的ATP混合物含有5μCi[γ- 32 P] -ATP和非放射性ATP，最终浓度为30μM。例如，可以通过混合0.5μl放射性ATP（10μCi/μl）和1.8μl0.5mM非放射性ATP来制备用于一个反应的ATP混合物。
注意：在计算所需体积时，必须考虑[γ - 32 P] -ATP的衰变速率每个反应。制造商指定校准或参考日期，其对应于放射性标记试剂的指示活性。该日期可用于确定进行测定当天放射性同位素的残留活性。例如，在[γ - 32 P] -ATP参考日期后两周进行实验，因为半衰期 32 P同位素的时间为14.29天，必须使用放射性标记的ATP体积的两倍来解释活性降低。因此，如上所述，不要将1.8μl的0.5 mM非放射性ATP与0.5μl放射性ATP混合，而应将1.8μl的0.5 mM非放射性ATP与1μl放射性ATP混合。每次反应的总体积应始终调整为30μl。

表1.每种激酶反应的成分
通过混合除ATP混合物之外的所有组分在冰上组装反应。如果多个反应将使用相同的底物，则可以制备包含10x反应缓冲液，底物和水的主混合物并将其分配到管中以最小化移液误差。
从这一步开始，必须采取放射性同位素的预防措施。准备足够的ATP混合物用于进行的测定数量。通过在每个试管中加入适量的ATP混合物来开始反应。
注意：必须采取放射性物质处理注意事项。其中包括使用适当的屏蔽材料，如有机玻璃屏蔽（3/8英寸厚），后面应完成所有工作，以及Perspex Eppendorf管架。 Geiger计数器应常规监测表面，并可使用环剂量计监测个人暴露情况。放射性同位素只能由机构生物安全法规规定的指定地点的授权人员使用。应按照机构的规定，对放射性物质，固体和液体放射性废物处理以及溢出物去污进行征用和储存。
将试管在30℃的水浴或沙浴中孵育30分钟。
通过加入10μl4xSDS样品缓冲液（在配方中列出）然后在95℃下煮沸5分钟来终止反应。旋转管子使反应组分进入管子底部。
将每个反应的全部体积加载到10孔聚丙烯酰胺凝胶的孔中。解析凝胶的百分比取决于测定中使用的蛋白质底物的分子量。以100-130恒定电压运行凝胶。当染料前端离凝胶底部约1-2厘米时，重要的是停止凝胶运行，以防止游离的[γ- 32 P] -ATP进入缓冲液中。凝胶罐。在染料正面上方切割凝胶，并将下部丢弃成固体放射性废物。
用足量的InstantBlue Coomassie蛋白质染色剂将凝胶染色30分钟，然后用去离子水洗涤两次，每次30分钟。或者，可以使用标准的考马斯蓝染色和脱色溶液。将用于染色和洗涤的溶液丢弃到液体放射性废物容器中。
将凝胶放在厚滤纸上，在70℃的凝胶干燥器中干燥60分钟。＆nbsp;
用X射线胶片暴露放射性适当的时间如下：
1. 在黑暗的房间里，将凝胶放在X射线胶片暗盒中，正上方有一个X光胶片。＆nbsp;
2. 关闭录像带并将其放入X光盒安全袋中以确保光线保护。增强屏幕的使用增强了信号。此外，将盒式磁带保持在-80°C冰箱中可以增强信号。＆nbsp;
3. 取决于激酶对特定底物的活性（底物的磷酸化水平），X射线胶片可暴露短至2-3小时，或长达1-2天。＆nbsp;
开发并固定X射线胶片，通过放射自显影观察底物磷酸化。出现在X射线胶片上的暗带对应于同位素标记的磷酸化底物。可以获得几次曝光以确保信号不会过饱和。
使用MBP作为底物的体外 ERK3激酶测定的代表性图像显示在图2中。第一泳道是缺乏ERK3的阴性对照反应。第二泳道是含有ERK3和MBP的反应。注意，在考马斯染色的凝胶中几乎看不到ERK3蛋白，因为其量很小，而放射自显影照片中磷酸化的ERK3条带的出现表明ERK3自身磷酸化。

图2.使用MBP作为底物的体外 ERK3激酶测定的代表性图像。具有N末端HA标签（HA-ERK3）的ERK3蛋白在293T细胞中表达。然后使用HA抗体缀合的珠子通过免疫沉淀纯化HA-ERK3蛋白质，然后用HA肽洗脱。体外激酶反应在[γ- 32 P] -ATP和MBP（1μg）存在下进行，有或没有100 ng纯化的ERK3（泳道2和分别为1）。通过考马斯染色显示两个反应中MBP的总蛋白水平（左图）。通过放射自显影检测MBP的磷酸化（右图）。

数据分析

通过使用标准扫描仪扫描干凝胶和显影的X射线胶片来分析数据，并使用诸如ImageJ的图像分析软件确定条带的强度。通过计算放射自显影照片中磷酸化底物的条带强度与考马斯染色凝胶中相应的总底物蛋白质的比率来完成底物磷酸化的定量。对于几个样品计算的比率可以各自标准化为参考条件。表2中显示了一个证明数据分析的假设示例：

表2.体外激酶测定数据分析的证明

食谱

10x激酶反应缓冲液（1 ml） class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：450px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>组件
最终集中
400μl1MTris-HCl pH 7.5
400mM Tris-HCl pH 7.5
100μl1MMgCl 2
100mM MgCl 2
10μl100mM EGTA
1 mM EGTA
10μl1M DTT
10 mM DTT
10μl磷酸酶抑制剂
1％
去离子水
加入1毫升
4x SDS样品缓冲液（10 ml） class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：450px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“2”>组件
最终集中
2.5ml 1M Mris-HCl pH 6.8
250mM Tris-HCl pH 6.8
4毫升100％甘油
40％甘油
0.8克SDS
8％SDS
40毫克溴酚蓝
0.4％溴酚蓝
0.5毫升β-巯基乙醇
5％β-巯基乙醇
去离子水
加入10毫升

致谢

该协议是由Cheng et al。（1996）的研究文章修改而来的。这项工作得到了赖特州立大学的启动基金和NCI 1R01CA193264-01给魏文龙的支持，以及莱特州立大学生物医学科学博士项目给Lobna Elkhadragy的支持。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考

Alsaran，H.，Elkhadragy，L.，Shakya，A。和Long，W。（2017）。 L290P / V突变增加了ERK3在癌细胞中的细胞质定位和迁移/侵袭促进能力。 Sci Rep 7（1）：14979。
Bian，K.，Muppani，N.R.，Elkhadragy，L.，Wang，W.，Zhang，C.，Chen，T.，Jung，S.，Seternes，O。M. and Long，W。（2016）。 ERK3调节肺癌细胞中TDP2介导的DNA损伤反应和化疗耐药性。 Oncotarget 7（6）：6665-6675。
Cheng，M.，Boulton，T。G.和Cobb，M。H.（1996）。 ERK3是一种组成型核蛋白激酶。 J Biol Chem 271（15）：8951-8958。
Coulombe，P。和Meloche，S。（2007）。非典型丝裂原活化蛋白激酶：结构，调节和功能。 Biochim Biophys Acta 1773（8）：1376-1387。
Elkhadragy，L.，Alsaran，H.，Morel，M。和Long，W。（2018）。激活环磷酸化ERK3对其激酶活性和促进肺癌细胞侵袭能力非常重要。< / a> J Biol Chem 293（42）：16193-16205。
Haubrich，B。A.和Swinney，D。C.（2016）。蛋白激酶的酶活性测定：识别活性底物的策略。 Curr药物Discov Technol 13（1）：2-15。
Long，W.，Foulds，CE，Qin，J.，Liu，J.，Ding，C.，Lonard，DM，Solis，LM，Wistuba，II，Qin，J.，Tsai，SY，Tsai，MJ和O 'Malley，BW（2012）。 ERK3通过SRC-3辅激活因子发出信号，促进人类肺癌细胞的侵袭。 J Clin Invest 122（5）：1869-1880。
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Seternes，O.M.，Mikalsen，T.，Johansen，B.，Michaelsen，E.，Armstrong，C.G.，Morrice，N.A.，Turgeon，B.，Meloche，S.，Moens，U。和Keyse，S.M。（2004）。非典型MAP激酶ERK3对MK5 / PRAK的激活定义了一种新的信号转导途径。 EMBO J 23（24）：4780-4791。