材料和试剂

Oris pro细胞迁移测定板，96孔（Platypus Technologies，目录号：PROCMA1），在室温下储存
3T3细胞（ATCC，目录号：CRL-1658），储存在液氮中
DMEM（Corning，目录号：10-101-CV），储存在4℃
胎牛血清（HyClone，目录号：SH3039603LR），储存在4℃
抗生素 - 抗真菌溶液（Corning，目录号：30-004-CI），储存在4℃
胰蛋白酶0.25％（Corning，目录号：25053CL），储存在4°C
PDGF-AA抗体（Millipore，目录号：07-1436），储存在-20℃
细胞培养基（见食谱）
完全补充的媒体（见食谱）
无血清培养基（见食谱）

设备

显微镜
Zeiss Axio Observer D1（卡尔蔡司）配备Yocogawa旋转轮，耦合光度计EMCCD相机（Evolve 512 delta）

软件

蔡司禅蓝（卡尔蔡司）
斐济/ ImageJ（ https://fiji.sc/ ）
棱镜（ https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ ）

程序

根据ATCC的说明，在完全补充的培养基（10％血清）中建立3T3细胞的健康培养物。
在实验当天，胰蛋白酶消化细胞，计数并重新悬浮在预热的无血清培养基中（每孔100μl）。每孔加入约5×10 4个细胞（100％汇合）至迁移测定板;此步骤可能需要根据单元大小和倍增时间进行优化。计划每个条件有3口井。让细胞粘附3小时。注意，孔中心的斑块在30分钟内溶解;因此，它仅适用于快速粘附的细胞。例如，我们发现新分选的原代小鼠肺成纤维细胞需要更长的粘附时间，并且我们未能从原代细胞获得一致的结果。
使用光学显微镜（未标记细胞的相差），验证细胞附着和每个孔中是否存在圆形无细胞区。排除在无细胞区域中具有过量细胞的孔或在细胞生长区域中具有不均匀的细胞分布（约5％的孔）。获取每个井的0小时时间点图片，记住对井和图像进行编号或命名。我们建议使用带有内置培养箱的显微镜，以避免对细胞造成额外的压力。
加入100μl预热的培养基和抗体/药物或条件培养基。确保所有孔具有相同的血清条件。例如，我们来自小鼠巨噬细胞的条件培养基含有10％的血清;因此，我们使用10％血清培养基来阻断抗体和所有对照孔。
在24小时获取图像，如果需要，在每个孔的稍后时间点获取图像。我们发现在48小时时，大多数井中的间隙完全闭合，并且间隙闭合的最显着差异发生在最初的24小时内。其他细胞类型可能需要更短的时间点，或者使用具有强效促分裂原的条件时可能需要更短的时间点。

数据分析

我们使用Zeiss显微镜软件Zen Blue来缝合以20倍放大率获得的孔的相衬图像。斐济（ImageJ）用于所有进一步的图像处理和数据分析。如图1所示，反转图像的颜色大大提高了无细胞区边界的清晰度。我们使用圆形选择工具手动选择无细胞区域0小时时间点图像和圆形或手动绘制（如果区域不是圆形）选择工具24小时时间点图像。我们在0小时时拍摄了井的单独照片，因为我们注意到孔之间无细胞区的尺寸变化很小。接下来，通过在斐济实施命令来测量选择区域：分析＆gt;测量＆gt;计算区域。我们将迁移区域计算为每个井在0 h和24 h时间区域之间的差异，平均一式三份井的面积，然后对数据进行归一化（即，我们将所有数据点都划分为所有数据点按“基线”组的平均值分组。我们使用双侧Wilcoxon秩和检验作为统计检验。

图1.成纤维细胞间隙闭合测定的代表性图像和定量。在0小时和24小时时拍摄3T3成纤维细胞的图片。为清楚起见，图像中的颜色被反转，黄色圆圈表示0小时时无细胞区域的边界和24小时时的蓝色圆圈。代表性数据来自Aran et al。，2019;将3T3成纤维细胞与来自肺巨噬细胞的条件培养基（CM）一起温育，所述条件培养基通过MHCII表达分选，有和没有PDGF-AA阻断抗体（AB）。给出了Wilcoxon检验双侧P值。 ** P ＆lt; 0.01。

食谱

细胞培养基
DMEM
胎牛血清
抗生素 - 抗真菌药物解决方案
胰蛋白酶
在无菌条件下制备细胞培养基
无血清培养基
DMEM
1％抗生素 - 抗真菌药
完全补充的媒体
DMEM
10％血清
1％抗生素 - 抗真菌剂

致谢

这项工作得到了加州大学旧金山分校马库斯奖和国家卫生研究院拨款（HL131560）给Mallar Bhattacharya的支持。
我们的化验使用市售的Oris Pro迁移试验（ https://www.platypustech.com/cell-migration），已针对此协议进行了优化和修改。

利益争夺

作者声明没有竞争性的经济利益。

参考

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