材料和试剂

培养皿90毫米（VWR，目录号：391-0440）
无菌木牙签＆nbsp;
无菌移液器吸头
50毫升和100毫升烧瓶（Duran，目录号分别为21-216-17和21-216-24）
1.5和2毫升管（Sarstedt，目录号：72.690.001; Fisherbrand，目录号：11393613）
聚苯乙烯/聚苯乙烯比色皿10 x 4 x 45 mm（SARSTEDT，目录号：67742）
半日志纸
玻璃珠3毫米（Sigma-Aldrich，目录号：Z143928-1EA）
枯草芽孢杆菌细胞（野生型菌株[ B. subtilis 168]或衍生物缺失突变体）
引物（Sigma Aldrich）
正向引物：5'-CATATAATACGCATGATTTGAGGGG
反向引物：5'-GTCCGTCGTAAAGCACTGTTTTG
质粒：pCB980; pCB981; pCB982; pCB983; pCB984; pCB1054; pCB985; pCB1056
注意：这些质粒先前已在Carrasco 等，2016和Carrasco 等，2019。
大肠杆菌 2,710-bp pUC57载体
双蒸H 2 O（ddH 2 O）
甘油（Sigma-Aldrich，目录号：G6279-4L）
利福平（Sigma-Aldrich，目录号：13292-46-1）
氨苄青霉素钠盐（Sigma-Aldrich，目录号：69-52-3）
质粒纯化试剂盒（Qiagen plasmid mini kit，目录号：27106）
Bacto胰蛋白胨胰蛋白酶消化酪蛋白（BD Biosciences，目录号：211705）
Bacto酵母提取物（自溶酵母细胞提取物）（BD Biosciences，目录号：211750）
欧洲细菌琼脂（Pronadisa，目录号：1800）
NaCl（VWR，目录号：7647-14-5）＆nbsp;
琼脂糖D1培养基EEO（Pronadisa，目录号：8021）
PCR纯化试剂盒（Speedtools PCR clean up kit，Biotools，目录号：740609.50.205571）
Na 2 HPO 4 （Calbiochem，Merck，目录号：7558-79-4）
KH 2 PO 4 （Calbiochem，Merck，目录号：7778-77-0）
K 2 HPO 4 （Calbiochem，Merck，目录号：16788-57-1）＆nbsp;
D - （+） - 葡萄糖（Sigma-Aldrich，目录号：50-99-7）＆nbsp;
柠檬酸三钠二水合物（Na 3 C 6 O 7 ·2H 2 O）（默克，目录号：6132-04-3）＆nbsp;
硫酸铵（MP Biomedical，目录号：7783-20-2）
Titriplex III（EDTA）（默克，目录号：6381-92-6）
醋酸冰醋酸（AppliChem PanReac，目录号：141008.1214）＆nbsp;
酪蛋白水解物（EMD，目录号：65072-00-6）＆nbsp;
CaCl 2 ·2H 2 O（默克，目录号：10035-04-8）
MgSO 4 ·7H 2 O（默克，目录号：10034-99-8）
色氨酸（默克，目录号：54-12-6）
蛋氨酸（默克，目录号：63-68-3）
Tris-HCl（AppliChem PanReac，目录号：A1086）
1 M Tris-HCl，pH 7.5（参见食谱）＆nbsp;
Luria Bertani（LB）肉汤（见食谱）
LB-agar（见食谱）
GM1（见食谱）
GM2（见食谱）
SBase10x（见食谱）
TAE 50x（见食谱）

设备

移液器
30和37°C培养箱
Amersham Biosciences Ultrospec 3100 Pro紫外/可见分光光度计（GE Healthcare）
加热块
微量＆NBSP;
热循环仪（VWR，Doppio，目录号：732-2551）＆nbsp;
NanoDrop TM 1000分光光度计（赛默飞世尔科技）
高压灭菌器
-80°C冰柜

软件

序列数据汇编
需要从相关数据库下载来自不同芽孢杆菌物种或亚种的 rpoB 基因的序列。建议的数据库是 NCBI 。在管家 rpoB 基因的密码子482（位置1,446）处的单个C至T转换突变赋予对利福平的抗性（Rif R ）。要生成 rpoB 482序列变体，需要在每个序列的1,446位置进行C到T的更改（参见图1A，星号）。
在线工具（ BLAST ）执行核苷酸比对

程序

枯草芽孢杆菌感受态细胞的制备
1. 条纹 B。枯草杆菌细胞到LB-琼脂平板上。
2. 将板在37℃孵育过夜（O / N）或室温（RT）2-3天。
3. 使用木材的无菌牙签，在50ml烧瓶中接种来自O / N板的单个菌落的5ml GM1，并在30℃下不通气培养O / N培养物。
4. 在15ml GM1中稀释过度生长的培养物以达到0.05 560 。
5. 将培养物分成两部分：含有10ml培养物的100ml烧瓶以测量OD 560 和含有5ml的50ml烧瓶以冷冻细胞。建议在两个烧瓶中划分培养物，以避免培养物被污染。由于多次OD 560 测量，可能会发生污染。
6. 将培养物在37℃下在培养箱中以250rpm孵育用于烧瓶。两小时后，每隔30分钟在OD 560 开始测量（来自100ml烧瓶用于测量）。在半对数纸中绘制数据以预测生长的指数期和稳定期之间的拐点（OD 560 约为1）。
7. 在达到生长曲线中的拐点一小时后，细胞变得有能力。此时，有两种选择（总是使用50毫升烧瓶中不会停止摇动的5毫升培养物）：转化细胞（参见步骤B3）或冻结细胞以便在其他时使用。为了冷冻细胞，加入甘油（终浓度为20％），并尽快将培养物分成2ml试管中的1ml等分试样并置于干冰上。将管保持在-80°C。
  注意：协议的这一部分是对Dubnau 等人，1973年和Alonso 等人之前描述的方法的改编。。，1988。
枯草芽孢杆菌染色体转化（见图1B）
1. 将冷冻细胞（1 ml）加入100 ml烧瓶中的10 ml GM2培养基（参见食谱）中。
2. 如上所述，将培养物在37℃下以振荡速度孵育1.5-2小时。
3. 将1 ml感受态细胞转移至2 ml管中：
  1. 一管没有DNA（阴性对照）（“管[ - ]”）。
  2. 一管含有1,000ng rpoB 482 DNA（pCB980-1056）（见表1和图1A）（“管[+]”）。应使用Nanodrop测量DNA浓度。
  表1.质粒携带的 rpoB 来自不同芽孢杆菌的482种变体克隆到 E中的物种或亚种。大肠杆菌 pUC57载体。管家 rpoB 基因编码RNA聚合酶的必需β亚基。 rpoB 基因中密码子482（位置1446）的单个C到T转换赋予对利福平的抗性（Rif R ）（Nicholson和Maughan，2002）。该突变被引入指定的芽孢杆菌物种或亚种的 rpoB 区域，导致 rpoB 482突变体变体用于选择Rif ^{R 转化体（参见图1A）。选择不同 rpoB 482基因的5'-和3'-末端的同源区以消除PCR扩增效率的变体。 rpoB 482基因的2,997-bp片段在体外合成并克隆到 Escherichia coli 2,710-bp pUC57载体（氨苄青霉素抗性）中。体外合成的DNA的准确性通过核苷酸序列（GeneWiz，London，UK）确认。}
4. 将管在37℃下孵育1小时，同时在250rpm的加热块中振荡。
5. 连续稀释和电镀。
  注意：根据 rpoB 482 DNA（参见表1）和使用的突变感受态细胞，应进行初步实验以确定所需的稀释范围。电镀。
  1. 对于电镀细胞总数，在LB中制备1:10连续稀释的“管（ - ）”（无DNA的阴性对照，参见步骤B3a）至10 -5 稀释液。使用玻璃珠将100μl所需稀释液置于LB-琼脂平板上。
  2. 为了对转化体进行平板接种（参见图1C），将“管（+）”（含DNA，参见步骤B3b）的1:10连续稀释液制成LB和板100中的10 -2 稀释液。将μl所需稀释液加到LB-琼脂平板上，使用玻璃珠补充利福平（8μg/ ml）。
    注意：当染色体转化效率受损时，可能需要10 0 和10 1 稀释液。在这种情况下，通过在室温（RT）下以900×g离心3分钟来收获细胞。微量离心管底部应该有一个可见的颗粒。将细胞重悬于100μlLB中，并使用玻璃珠将整个体积平板置于补充有利福平（8μg/ ml）的LB琼脂平板上。
  3. 对于自发性利福平耐药（Rif R ）细胞的培养，将“管（ - ）”（不含DNA的阴性对照，参见步骤B3a）置于与最浓缩的转化体稀释液相同的稀释液中（见步骤B5b）使用玻璃珠在补充有利福平（8μg/ ml）的LB琼脂平板上。
  4. 将板在37℃孵育过夜，或在室温下放置2-3天。
  5. 在最合适的平板上计数菌落（包含大约100-1000个菌落的平板）。每个平板上的菌落必须乘以它们的稀释倍数，以获得菌落形成单位（CFU）/ ml。
    注意：为了减少不同实验之间的差异，从适当的稀释度计算每个板100-500 CFU。
来自Rif R 转化体的 rpoB 482 DNA的PCR扩增（见图1C）
1. 裂解转化细胞
  1. 用无菌牙签捡起一个菌落并将其插入含有20μlddH 2 O的1.5 ml管中，并在95°C下将管孵育5分钟。
    注意：有必要通过PCR扩增并发送测序几个实例（几个单菌落），这是由每个DNA的转化产生的。这是因为重组点可以变化（从一个到另一个），使得终点和积分长度也变化。最后，我们将积分长度确定为每个条件的不同示例的长度平均值。
  2. 在室温下以20,000 x g 离心5分钟。
  3. 每个PCR反应使用2μl上清液作为DNA模板。
2. 每次反应进行20μlPCR。
  1. 通过将以下组分添加到冰上的PCR管中来设置PCR：
    不含DNA酶的ddH 2 O11.5μl
    dNTP混合物（每种2.5μM）2μl
    正向引物（10μM）（见表2）2μl
    反向引物（10μM）（见表2）1μl
    PCR缓冲液（10x）2μl
    Taq DNA聚合酶（250单位）2μl
    上清液裂解物（DNA模板）2μl
    
    表2.引物这些引物与2,997-bp rpoB 482 DNA的上游和下游区域杂交。这些引物用于该方案，用于扩增和测序来自Rif R 转化体的 rpoB 482基因。
  2. 运行PCR： class =“ke-zeroborder”bordercolor =“＃000000”style =“width：700px;” border =“0”cellspacing =“0”cellpadding =“0”>1个周期
    94°C，10分钟
    30个周期
    94°C，1分钟; 55°C，1分钟和30秒; 72°C，2分钟和45秒
    1个周期
    72°C，10分钟
  3. 在用EtBr染色的1x TAE中的0.8％琼脂糖凝胶上加载2μlPCR产物。在1x TAE缓冲液中以5至8V / Cm在室温下运行凝胶1小时（预期条带为2,997bp）。在紫外光下观察凝胶。
  4. 使用PCR纯化试剂盒纯化PCR产物（参见材料和试剂）。
图1. 枯草芽孢杆菌天然染色体转化和平均整合检测。 A.不同芽孢杆菌物种之间序列差异的分布。在必需的 rpoB 基因中，密码子482处的单个C-to-T转换突变（用星号表示）使得 rpoB 482基因具有rifampicin抗性（Rif） - [R ）。 rpoB 482 DNA来源于 B. subtilis 168（ Bsu 168）， B。 subtilis W23（ Bsu W23）， B. atrophaeus 1942年（ Bat 1942）， B. amyloliquefaciens DSM7（ Bam DSM7）， B.地衣芽孢杆菌 DSM13（ Bli DSM13）， B. gobiensis FJAT-4402（ Bgo FJAT4402）， B. thuringiensis MC28（ Bth MC28）和 B。史密斯 DSM4512（ Bsm DSM4216）。 Rif R 供体与利福平敏感受体菌株中相应的 rpoB 之间的错配由垂直红条表示，并且通过垂直黑条表示插入/缺失。条形厚度表示特定区域中的不匹配数。 B.染色体转化。 RecA介导的 rpoB 482供体DNA（红色）和受体 rpoB 基因（黑色）之间的同源重组。 C.测量整合供体DNA进入受体的长度。使用在 rpoB 基因的上游和下游杂交的DNA引物（蓝色箭头）PCR扩增Rif R 转化体。第一次预测和第一次观察到的不匹配之间的平均长度检测定义了终点区域。
排序
发送与前向和/或反向引物混合的每种PCR产物的测序（见表2）（按照公司的说明）。
计算分析
运行两个不同的核苷酸BLAST：
1. BLAST-1（参见图2A）：可视化Rif R 供体DNA（参见表1）与相应的 rpoB 之间未对齐的碱基（此处定义为错配）在利福平敏感受体菌株中，使用每个 rpoB 482变体序列（供体DNA）（参见表1）作为针对管家 rpoB <的查询序列运行核苷酸BLAST。 / em>基因序列（受体DNA）作为主题序列。
  注意：供体和受体DNA之间存在或不存在错配将用于确定整体整合长度。
2. BLAST-2（参见图2B）：使用供体DNA来源显示来自Rif R 转化体的碱基，使用管家 rpoB 基因序列运行核苷酸BLAST（受体DNA）作为针对每个Rif R 转化体序列的查询序列（参见程序D）作为主题序列。
  
  图2.整合序列的分析和整合长度的测量。 A.使用 rpoB 482供体DNA（不同芽孢杆菌）的BLAST-1的示意图起源）（红线）作为针对作为主题序列的管家 rpoB 基因序列（受体DNA）（黑线）的查询序列。黑色虚线表示“预测的第一个不匹配”。 B.使用管家 rpoB 基因序列（受体DNA）（黑线）作为针对来自Rif R 转化体DNA（蓝线）作为主题。黑色虚线表示“观察到的第一个不匹配”。端点定义为第一次预测和第一次观察到的错配之间的平均区域，并代表重组点。积分长度计算为两个端点之间的减法。黑点代表DNA碱基，蓝色垂直线代表两个序列之间排列的碱基。赋予利福平抗性的突变用星号表示。

数据分析

染色体转化效率
每个平板上的菌落必须乘以它们的稀释因子以获得CFU / ml（参见“步骤B5e”）。对于数据分析，使用下式计算转化效率：染色体转化效率= TE / Nf，其中“T”对应于转化体（参见步骤B5b），“E”对应于自发Rif R 单元格（参见步骤B5c）和“Nf”是单元格的总数（参见“步骤B5e”）。
分析整合序列
1. 转到生成的BLAST-2（参见步骤E2和图2B）并观察通过转化整合到受体DNA中的供体DNA片段（参见图1C和2B）。
  注意：这两个序列之间对齐的碱基对应于受体DNA的部分，而错配代表Rif R sup> 转化序列。＆nbsp;
2. 转到得到的BLAST-2（参见步骤E2和图2B）并搜索查询（受体DNA）和受试者（Rif R 转化体DNA）序列之间的第一个错配，以鉴定“第一次不匹配“。
积分终点图
我们将终点定义为整合到受体DNA中的供体DNA序列的边界。
1. 知道“观察到的第一个不匹配”的位置（参见数据分析B），在得到的BLAST-1中进入该位置（参见步骤E1和图2A）并向上游搜索序列，查询序列之间的第一个不匹配（受体DNA）和感兴趣的主题序列（取决于所用的供体DNA）以鉴定“预测的第一个错配”。
2. 使用以下公式计算终点：end-point = Fp-Fo / 2，其中“Fp”对应于“预测的第一个不匹配”，“Fo”对应于“观察到的第一个不匹配”。
  注意：我们假设重组事件发生在整合到受体DNA中的供体DNA序列边界的终点之间。有必要确定两个边界的“第一次预测”和“第一次观察到的”不匹配，以确定两个终点（见图2）。
确定积分长度
计算积分长度作为两个端点之间的减法（见图2）。

食谱

1 M Tris-HCl，pH 7.5
在1L超纯水中稀释121.1g Tris，用HCl调节pH至7.4
Luria Bertani（LB）肉汤
10克/升Bacto胰蛋白胨
5 g / L Bacto酵母提取物
10 g / L NaCl
通过高压灭菌消毒
LB-agar
LB媒体
12克/升琼脂
通过高压灭菌消毒
GM1（表3）
注意：使用真空过滤过滤GM1培养基并在4°C下储存。

表3. GM1培养基配方
GM2（表4）
注意：GM2培养基应在使用前准备好。

表4. GM2培养基配方
SBase 10x（表5）

表5. SBase 10x食谱
TAE 50x（表6）

表6. TAE 50x配方和准备

致谢

这项工作得到了Universion de Ciencia，InnovaciónyUniversidades（MICINN）/ FEDER PGC2018-097054-B-I00对J. C. Alonso的支持。 ES感谢MINECO（BES-2013-063433）的奖学金和B.C感谢Programa Centros de Excelencia Severo Ocho-CNB的奖学金。

利益争夺

作者在这项工作中没有利益冲突或利益冲突。

参考

Alonso，J。C.，Tailor，R。H.和Luder，G。（1988）。 Bacillus subtilis 的重组缺陷型突变体的表征。 J Bacteriol 。 170（7）：3001-3007。
Carrasco，B.，Serrano，E.，Martin-Gonzalez，A.，Moreno-Herrero，F。和Alonso，J。C.（2019）。 Bacillus subtilis MutS调节不同DNA序列之间RecA介导的DNA链交换。 Front Microbiol 10：237。
Carrasco，B.，Serrano，E.，Sanchez，H.，Wyman，C。和Alonso，J。C.（2016）。 Bacillus subtilis 中的染色体转化是一种非极性重组反应。< / a> Nucleic Acids Res 44（6）：2754-2768。
Chen，I.，Christie，P。J.和Dubnau，D。（2005）。细菌中DNA转移的来龙去脉。 Science 310（5753）：1456-1460。
Chen，I。和Dubnau，D。（2004）。细菌转化过程中的DNA摄取。 Nat Rev Microbiol 2 （3）：241-249。
Dubnau，D.，Davidoff-Abelson，R.，Scher，B。和Cirigliano，C。（1973）受感染的枯草芽孢杆菌摄取后转化脱氧核糖核酸的命运：对辐射敏感的重组缺陷型突变体的表型特征。 J Bacteriol 114（1）：273-286。
Johnston，C.，Campo，N.，Berge，M.J.，Polard，P。和Claverys，J.P。（2014）。 Streptococcus pneumoniae ，le transformiste。趋势微生物 22（3）：113-119。
Kidane，D.，Ayora，S.，Sweasy，J.B.，Graumann，P。L.和Alonso，J。C.（2012）。细胞极点：DNA摄取和基因重组机制之间的串扰点。 Crit Rev Biochem Mol Biol 47（6）：531-555。
Nicholson，W。L.和Maughan，H。（2002）。 rpoB 基因中自发利福平抗性突变谱>枯草芽孢杆菌 168孢子与营养细胞不同，类似于结核分枝杆菌。细菌学杂志。 184（17）：4936-4940。
Takeuchi，N.，Kaneko，K。和Koonin，E。V.（2014）。水平基因转移可以从Muller的棘轮中拯救原核生物：来自死细胞和人口细分的DNA的益处。 G3（Bethesda） 4（2）：325-339。
Thomas，C。M.和Nielsen，K。M.（2005）。细菌间水平基因转移的机制和障碍。 Nat Rev Microbiol 3（9）：711-721。
Yadav，T.，Carrasco，B.，Hejna，J.，Suzuki，Y.，Takeyasu，K。和Alonso，J。C.（2013）。 Bacillus subtilis DprA将RecA募集到单链DNA上并介导退火由SsbB和SsbA包被的互补链。 J Biol Chem 288（31）：22437-22450。
Yadav，T.，Carrasco，B.，Myers，A.R.，George，N.P.，Keck，J.L。和Alonso，J.C。（2012）。 Bacillus subtilis 中的遗传重组：两个单一的分工链DNA结合蛋白。 Nucleic Acids Res 40（12）：5546-5559。