材料和试剂

移液器吸头
显微镜盖玻片，50 x 20 mm和20 x 20 mm（CITOTEST，P / N：80340-0630,80340-3610）
显微镜载玻片（CITOTEST，P / N：80320-2140）
15毫升圆底管
10厘米玻璃培养皿
1.5毫升离心管
胶带
剃刀片
过滤纸
酵母（ Saccharomyces cerevisiae ，BY4742）
拟南芥幼苗（Col-0）
玉米（ Zea mays ，B73）
FM4-64（N-（3-三乙基铵丙基）-4-（6-（4-（二乙基氨基）苯基）六噻吩基）吡啶鎓二溴化物）（Thermo Fisher Scientific，目录号：T3166）
DMSO（二甲基亚砜）（MP Biomedicals，目录号：196055）
台盼蓝（Solarbio，目录号：T8070）
Murashige和Skoog（MS）盐（Phyto Technology Laboratories，目录号：M519）
蔗糖（广州金华达化学试剂，CAS：57-50-1）
琼脂（Solarbio，目录号：A8190）
胰蛋白胨（OXIOD，目录号：LP0042）
酵母提取物（OXIOD，目录号：LP0021）
NaCl（广州金华达化学试剂，CAS：7647-14-5）
葡萄糖（广州金华达化学试剂，CAS：58367-01-4）
Na 2 HPO 4 （广州金华达化学试剂，CAS：10039-32-4）
KH 2 PO 4 （广州金华达化学试剂，CAS：7778-77-0）
KCl（广州金华达化学试剂，CAS：7447-40-7）
KOH＆NBSP;
YDP培养基（见食谱）
半强度MS培养基（见食谱）
PBS溶液（pH 7.2-7.4）（见食谱）
FM4-64储备液（见食谱）
台盼蓝原液（见食谱）

设备

钳子
剪刀
染色罐子
移液器，10,100,1000μl（Thermo Scientific，型号：PZ31631，PZ69795，QZ06709）
离心机（Sigma，型号：1-14）
分析天平（Adam Equipment，型号：PWC 124）
高压灭菌器（ZEALWAY，型号：GR60DP）
水净化系统（Synergy，型号：SYNSVHF00）
空气洁净工作台（AIRTECH，型号：SW-CJ-2FD）
摇床培养箱（南荣，型号：NRY-200）
植物生长室（NINGBO SOUTHEAST INSTRUMENT，型号：GDN-1000D-4）
共聚焦荧光显微镜（徕卡，型号：DMi8，带ThorLabs模块，型号：ThorLabs-CLS）
注意：该协议还在使用sCMOS相机的荧光宽场显微镜系统上进行了测试。这些可用于代替共聚焦显微镜，只要能够以高信噪比可视化清晰聚焦的质膜部分。
电脑（戴尔，型号：U2717D）

软件

ThorImageLS 3.0（Thorlabs）
ImageJ 1.52n（美国国立卫生研究院。美国， http://imagej.nih.gov/ij ）（Schindelin et al。，2012）

程序

酵母样品
1. 将培养酵母细胞置于圆底管中的5ml YPD培养基（参见配方）中，在摇床培养箱中于30℃培养24小时或根据特定菌株或特定实验的要求。
2. 将500μl培养物转移到离心管中，在4,000 x g 下离心1分钟并弃去上清液。
3. 将细胞重悬于1ml PBS（pH 7.2-7.4，参见配方）中，在4,000 x g 下离心1分钟并弃去上清液。
4. 将细胞重悬于50μl基于PBS的FM4-64溶液（50μM）中并在室温下在黑暗中孵育3分钟。
  注意：将FM4-64溶液置于黑暗中，并将储备液置于冰上。已经用FM4-64标记的样品应在10分钟内成像，因为染料最终将被内吞。内部信号表明FM4-64的内吞作用，通常以小球体的形式出现。
5. 加入1 ml PBS溶液，在4,000 x g 下离心1分钟，弃去上清液。重复此步骤一次。
6. 将2μl染色的细胞转移到显微镜载玻片上并加入10μlPBS，通过用移液管尖端搅拌混合并盖上盖玻片。
  注意：如果在成像过程中细胞运动存在问题，酵母细胞可以固定在涂有聚赖氨酸或琼脂糖垫的载玻片上。
7. 将载玻片安装在显微镜上，使用100倍物镜的明场模式定位细胞。
  注意：特别是对于微生物样本，重要的是尽量减少激光照射，这会导致漂白。因此，建议在切换到共焦模式之前在明场模式下调整焦距并立即获取图像。
8. 切换到使用488 nm或514 nm激光器和582/75 nm带通发射滤光片进行共焦采集，以检测FM4-64发射（参见注释）。针孔直径应低于两个透气盘（约100微米）。
9. 设置成像参数（激光功率，探测器增益或曝光时间）以获得明亮的信号而不会过度曝光。＆nbsp;
10. 获取图像。通常，可以拍摄每个样品3-6个不同区域的一个图像。
11. 在步骤A2至A8之后制备另外的样品，但不是在步骤A6中向载玻片中添加PBS，而是添加基于PBS的台盼蓝溶液，每次使用不同浓度（1,5,10,50和100μM）。在不改变任何成像参数的情况下获取每个样品的图像。＆nbsp;
拟南芥 thaliana 幼苗根样品
1. 在板上的半强度MS培养基中生长拟南芥幼苗（参见食谱），在22℃，16小时光照/ 8小时黑暗处理7天（图1）。
2. 将整个幼苗放入含有20μM基于PBS的FM4-64溶液的管中，孵育3分钟并用染色罐中的PBS溶液洗涤。
3. 将50μlPBS添加到显微镜载玻片上，将幼苗布置在载玻片上，并将盖玻片添加到幼苗的根部（图1）。
4. 使用40x物镜和明场模式找到目标区域，例如伸长区域。＆nbsp;
5. 切换到使用488 nm或514 nm激光器和582/75 nm带通发射滤光片进行共焦采集，以检测FM4-64发射（参见注释）。针孔直径应低于两个透气盘（约100微米）。
6. 设置成像参数（激光功率，探测器增益或曝光时间），以提供明亮的信号而不会过度曝光。＆nbsp;
7. 获取图像。通常，每个样品可以拍摄1-3个不同区域的图像。
8. 在步骤B2至B5之后制备另外的样品，但是不是在步骤B3中向载玻片中添加PBS，而是添加基于PBS的台盼蓝溶液，每次使用不同浓度（1,5,10,50和100μM）。在不改变任何成像参数的情况下获取每个样品的图像。
  
  图1. 拟南芥根样品的制备。 A.在板上生长的7日龄幼苗。 B.将根浸没在FM4-64溶液中的幼苗。 C.在PBS缓冲液中在染色罐中洗涤幼苗。 D.幼苗安装在滑盖上，根部覆盖着滑盖。
玉米叶样品

沿着大盖玻片的长边放两层胶带，在中间留下一个凹槽（图2）。这有助于在不移动样品的情况下有效交换猝灭剂溶液。
注意：尽管此操作比其他样品描述的操作更复杂，但是当在同一电池上测量所有猝灭剂浓度的影响时，它可以导致更高的数据可靠性。整个方案应在10到15分钟内完成，以防止FM4-64内吞作用影响结果。＆nbsp;
使用剃刀刀片切成玉米叶，并用镊子开始剥离下表皮。将一小片叶子与去皮的表皮一起切开（图2）。
注意：将玉米叶表皮与叶片的其余部分分开，有助于通过最小化叶绿素荧光提供更可靠的结果，叶绿素荧光的光谱与FM4-64的光谱重叠。
在离心管中用50μM基于PBS的FM4-64溶液染色样品3分钟，用PBS缓冲液在染色罐中洗涤（图2）。
将100μlPBS加入大盖玻片的凹槽中，并将玉米叶样品放入其中。用方形盖玻片盖住样品（图2）。
在明场模式下使用40x物镜找到目标区域。＆nbsp;
切换到使用488 nm或514 nm激光器和582/75 nm带通发射滤光片进行共焦采集，以检测FM4-64发射（参见注释）。针孔直径应低于两个透气盘（约100微米）。
设置成像参数（激光功率，探测器增益或曝光时间），以提供明亮的信号而不会过度曝光。＆nbsp;
获取目标区域的一个图像。＆nbsp;
在不从显微镜中取出样品的情况下，使用滤纸排出缓冲液，立即加入基于PBS的台盼蓝溶液，从最低浓度（1μM）开始。
如上面的步骤所述，获取一个图像并改变到下一个更高的浓度。重复上述步骤，直至获得所有浓度（1,5,10,50,100μM）的图像。

图2.玉米叶片样品的制备 A.玉米幼苗，此处用作样品材料。 B.使用镊子将一段表皮（箭头）从叶子上剥下，并与一小片叶片一起切出。 C.样品浸没在FM4-64溶液中。 D.样品在PBS中在染色罐中洗涤。 E.样品安装在大盖玻片上，通过粘贴边缘在其上形成中央凹槽。 F.应用小盖玻片后的样品。 G.在不从显微镜中取出样品的情况下改变猝灭剂溶液。

数据分析

从成像系统以与ImageJ兼容的格式（例如，tif）导出所有图像数据并导入ImageJ。＆nbsp;
通过检查细胞之间（如果是酵母或细菌细胞）或细胞中心（如果细胞较大的情况）中的背景信号强度消除背景信号，将黑色水平调整为此值并按“应用”（图3）。

图3.通过调整黑色水平进行背景扣除。 A. 拟南芥根样品，在不含质膜的区域绘制感兴趣区域。 B.此区域的平均值用作按“应用”重新分配的图像的黑色电平和强度值。
画一个覆盖细胞周边的矩形感兴趣区域（ROI）（图4），按“Ctrl + M”测量平均灰度值。请勿更改一种样本类型的不同图像之间的ROI大小。如果应在多个图像上测量相同的区域，例如，对于玉米叶样本，将ROI添加到ROI管理器。＆nbsp;
为每种类型的样品和每种猝灭剂浓度测量至少50个ROI。在酵母样品中，每个细胞定义一个ROI。在植物样本中，可以在同一细胞的不同壁上定义几个ROI。

图4.用于测量信号强度的示例性感兴趣区域。 A.酵母细胞。 B. 拟南芥根细胞。 C.玉米叶细胞。比例尺，10μm。
将测量数据导出到电子表格软件并计算平均值。
根据Lehrer（1971）计算淬火效率：

其中，F 0 是缓冲液中没有台盼蓝的样品的荧光强度; F是在浓度为[Q]的台盼蓝存在下样品的荧光强度;
K是该样品系统的猝灭效率，其可以从浓度的斜率[Q]（x轴）得出，而不是（y轴）。

较高的猝灭效率表明猝灭剂更容易进入质膜，这可以作为细胞壁孔隙度的良好指标（Liu et al。，2019）。关于猝灭效率和细胞壁结构之间关系的详细讨论可以在Liu 等人，，（2019）中找到。从同一样品中获得的结果变化取决于样品类型（图5）。

图5.在酵母和植物细胞上测量的示例性猝灭效率数据。将样品暴露于化学处理或在生长条件下改变12小时（酵母）或24小时（植物）。植物样品中一个处理组内的变异通常高于酵母样品。＆nbsp;

笔记

FM4-64的发射在640nm和750nm附近显示出宽峰。台盼蓝在与640和680nm之间的某些细胞壁组分结合时显示出发出荧光（Liesche 等，，2015）。为避免与潜在的台盼蓝发射重叠，建议检测580 nm附近的FM4-64或超过700 nm的长通滤波器。

食谱

注意：使用超纯水准备所有介质（从25°C时设置为电阻率为18MΩcm的净化系统中提取）。

YDP媒体
2％（w / v）胰蛋白胨
1％（w / v）酵母提取物
2％（w / v）葡萄糖
注意：胰蛋白胨和酵母提取物以及葡萄糖溶液的混合物应在121°C下灭菌20分钟，并在冷却后调整至最终浓度。
半强度MS培养基
0.22％（w / v）Murashige和Skoog（MS）盐
1％（w / v）蔗糖
用2 M KOH将pH调节至5.8 0.8％（w / v）琼脂
在121℃下灭菌20分钟，向每个玻璃培养皿中倒入25ml培养基
PBS溶液（pH 7.2-7.4）
NaCl 130 mM
KCl 2.6 mM
Na 2 HPO 4 7 mM
KH 2 PO 4 1.2mM
FM4-64库存解决方案
在DMSO中制备2mM FM4-64储备液
在-20°C下在黑暗中以100μl的等分试样储存
台盼蓝蓝色库存解决方案
在PBS中制备10 mM锥虫蓝原液，在黑暗中保持4°C
注意：在通风橱内或抽吸下将天平称重，并在处理固体时戴上口罩。台盼蓝被怀疑会导致癌症，特别是粉末状，因为它很容易被吸入。

致谢

该协议改编自我们以前的工作（Liu et al。，2019）。这项工作得到了国家自然科学基金（项目拨款号31700313），陕西省科学基金（100人才计划）和Villum基金会（项目拨款号022868）的支持。

利益争夺

作者声明不存在竞争利益。

参考

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