< BR> 第一部分：crispra at基因启动子的sgrna靶向序列鉴定及将靶序列克隆到sgrna支架中

材料和试剂

吸管（Rainin，目录号：17014415和17014393）
1-2L通风挡板烧瓶（Fisher Scientific，目录号：50-121-4761和50-153-2267）
吸管头（Denville，目录号：1159M43、1159M40、1159M42；Rainin，目录号：30389274）
康宁猎鹰圆底聚苯乙烯管（Fisher，目录号：14-959-7）
纳尔金通用长期储存低温管，无菌，1.5毫升（费希尔，目录号：03-337-7Y）
具有正确悬挑的定制低聚物（第二部分概述），标准脱盐净化
U6验证底漆：TTTCTTGGGTAGTTTGCAGTTT
T4多核苷酸激酶（PNK）（NEB，目录号：M0201S）
一次性STBL3化学活性大肠杆菌（Invitrogen，目录号：C737303）
DNA连接酶（NEB，目录号：M0202S）
小扁豆U6 SGRNA/EF1A Mcherry（addgene，目录号：114199）
Nebuffer 2（Neb，目录号：B7002s）
快速文摘BPII（BBSI）（赛默飞世尔，目录号：FD1014）
碱性磷酸酶，小牛肠（CIP）（NEB，目录号：M0290S）
高压灭菌毫质量h2o
PCR纯化试剂盒（桥根，目录号：28106）
T4结扎反应缓冲液（NEB，目录号：b020s）
Immedia生长培养基，琼脂，氨苄西林（Invitrogen，目录号：450034）
注意：按照制造商的说明准备板。
S.O.C.介质（Invitrogen，目录号：15544034）
氨苄西林钠盐（Gibco，目录号：11593-027）
注：在无菌H2O中再次使用，在-20°C下储存等份。
Qiaprep Spin Miniprep Kit（Qiagen，目录号：27106）
带标准缓冲区的OneTaq 2x主混音（NEB，目录号：M0482S）
Purelink Hipure质粒过滤器MIDIPREP试剂盒（Fisher，目录号：K210015）
purelink hipure质粒过滤器maxiprep试剂盒（fisher，目录号：k210017）
TE缓冲区
2xyt氨苄青霉素肉汤（见配方）
1. 胰蛋白胨（Fisher，目录号：BP1421-500）
2. 酵母抽提物（Fisher，目录号：BP1422-500）
3. 氯化钠（Fisher，目录号：S271-1）

设备

-80°C冷冻柜（Thermo Fisher Scientific，型号：UXF60086A63）
热循环器（Bio-Rad，C1000触摸式热循环器）
热块（Fisher Scientific，微型热块14955218）
设置为37°C和225转/分的大型孵化轨道振动筛（新不伦瑞克，G-25控制环境孵化器振动筛）
小型摇瓶机/培养箱设置为37°C（Fisher Scientific，微型摇瓶机02217753）
台式离心机（Eppendorf，型号：5340）
可容纳50ml锥形管，速度可达12000x g的冷冻离心机（Eppendorf，型号：5810R）
凝胶电泳设备（Bi-RAD，MIN亚细胞GT细胞）

程序

图1概述了这一过程。
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图1。将基因特异性靶向序列插入到sgrna支架中。a.通过公开的crispr/dcas9靶点选择工具，在感兴趣基因转录起始位点（tss）500 bp内选择靶区。靶向序列紧邻原间隔基序邻接基序（pam），是spcas9靶向所必需的。b.含有靶位和独特的bbsi/em的寡聚体被（顶部）退火和（底部）磷酸化以产生dsdna片段插入sgrna支架质粒。c.将小扁豆u6-sgrna/ef1a-mcherry质粒经bbsi消化，脱磷（顶部），然后将退火的靶向序列连接到切割的主干（底部）。d.质粒转化并扩增后，进行PCR反应以验证靶向序列的正确插入。

利用公开的crispr/cas9 sgrna预测工具（我们推荐chopchop或e-crisp）在基因转录起始位点（tss）上游2kb范围内进行靶向，通常称为启动子区。虽然我们观察到成功的crispra从tss（甚至远端基因增强子）中获得了高达2kb的sgrnas，但我们观察到sgrnas靶向tss上游500bp内的最稳健结果。
1. sgrna预测工具通常在3bp的pam序列之前输出20bp的靶向序列。pam序列特定于所用cas9/dcas9的种类。该协议中的crispr激活结构使用ngg的pam序列。不要将pam站点作为插入的目标序列的一部分。
2. 或者，该工具可以搜索特定的基因组坐标，这些坐标可以使用公开可用的数据库获得，例如，ucsc基因组浏览器或ncbi基因。
3. 选择在基因组中其他位点没有预测错配的靶向序列。
4. 重复这个过程，获得覆盖两条DNA链的3-5个额外的SGRNA靶点。
对具有以下悬垂的寡糖进行排序，以使目标序列与小扁豆u6 sgrna/ef1a mcherry结构相容。
1. U6启动子需要一个“G”核苷酸来启动转录。因此，如果目标序列不是以g开头，则必须替换第一个碱基对。
2. 订购低聚物时，应增加以下悬挑：
  意义：5′-cacc（g）nnnnnnnnnnnnnnnnn-3′
  反义：5′-aaacnnnnnnnnnnnnnnnnn（c）-3′
  1. 反义是义靶序列的反义补体。
  2. n：ngg-pam序列之前的靶向序列。
  3. CACC/AAAC：必须包括在SGRNA支架上的悬垂物。
  4. （g）/（c）：如果靶向序列的第一个核苷酸不是以g开头，则替换它。
如有必要，再将寡聚物（如有必要）在20微升的PCR管反应中混合正义寡聚物和反义寡聚物，在1X PBS中稀释至各10μm。用以下热循环程序对低聚物进行退火：95°C用于180 S，85°C用于20 S，75°C用于20 S，65°C用于20 S，55°C用于20 S，45°C用于20 S，35°C用于20 S和25°C用于20 S，两步之间的下降率为0.1°C/s。最后保持4°C。
在PCR管中进行标准的20微升PNK反应，使用5微升退火的寡糖反应作为DNA输入：
2微升neb t4连接缓冲液
步骤3的5μl退火低聚物反应
12微升毫克小时2o
1微升T4 PNK
注：根据atp的要求，用neb t4 pnk缓冲液代替neb t4连接缓冲液。
1. 用以下热循环程序孵育反应：37°C孵育30分钟，65°C孵育20分钟，4°C孵育。
2. 反应完成后，将反应稀释1:50（反应：milliq h2o）。
用bpii/bbsi在标准的30微升反应中消化1微克的小扁豆u6 sgrna/ef1a mcherry，并添加cip:
1微克小扁豆u6 sgrna/ef1a mcherry
3微升Nebuffer 2
0.1微升CIP
1微升bpii/bbsi
毫当量h2o至30微升
在37℃下孵育反应1h。
注：
1. 质粒必须溶于水或不含edta的缓冲液中，否则会抑制反应。
2. 用热消化缓冲液代替Nebuffer 2。
使用Qiagen PCR纯化试剂盒对步骤5中消化的质粒进行PCR清除。在20-30μl缓冲液eb中洗脱被消化的质粒。测定消化质粒的浓度。
注：无需在凝胶上提取产品并提取。切除的产物约为20 bp，不会被清除柱保留。
用标准的t4连接酶反应将退火的靶序列连接到消化的sgrna支架：
2μl 10x T4 DNA连接酶缓冲液
1.5微升稀释PNK反应
50ng洗脱、消化的sgrna支架质粒
1微升T4 DNA连接酶（最后添加）
毫厘水至20微升
在热循环器中运行反应：23°C持续15分钟，65°C持续20分钟，4°C保持。
完成后冷却结扎冰，从-80°C取出astbl3试管并放在冰上。
注意：务必使用stbl3或类似的大肠杆菌菌株来维持慢病毒ltrs。
将连接的sgrna转化为stbl3s：
1. 无菌条件下，向试管中加入4微升结扎反应，轻轻敲打。不要用移液管混合或旋涡。
2. 在冰上休息30分钟。
3. 通过在42℃下在热块上孵育30 s来加热休克细胞。立即回到冰上并休息至少2分钟。
4. 无菌添加250微升S.O.C.培养基，在37°C的大培养箱中培养1小时，225转/分眼眶震动。将制备好的氨苄西林琼脂板放在37°C的小培养箱中加热。
5. 用无菌的L型撒布器（玻璃或一次性塑料），将50微升转化子均匀地分布在加热的氨苄西林琼脂板上。翻转平板，使琼脂在顶部，在37°C的小培养箱中培养过夜。
用无菌移液管尖端接触单个菌落，并将其滴入圆形底烧瓶，以无菌方式将14ml圆形底管接种3ml 2xyt+氨苄西林肉汤。在37°C条件下培养过夜（总时间不超过16小时），在一个大型培养箱中以250转/分的速度振荡轨道。
无菌制备由500微升细菌培养物和500微升1:1（无菌水：甘油）组成的甘油储备液，置于冷冻瓶中（储存于-80°C），然后使用Qiaprep Spin-Miniprep试剂盒用剩余培养液制备质粒，并在50微升缓冲液EB中洗脱。
为了验证靶向序列是否正确插入，在PCR管中建立标准的10微升onetaq反应：
5微升onetaq 2x主混合液
1微升稀释质粒（稀释至1-5纳克/微升）
0.2μl U6验证底漆（10μm）
0.2微升定制反义寡聚物（10微米）
3.6微升h2o
在热循环器中运行反应：94°C 30 s，30个循环（94°C 15 s，54°C 15 s，68°C 15 s），68°C 5 min，4°C保持。
在2%琼脂糖凝胶上分离pcr反应。注：
1. 如果插入正确，应该有一个140 bp的产品。如果需要的话，非靶SGRNA反义寡核苷酸可以用作阴性对照反应。
2. 如果需要桑格测序来验证正确的目标序列插入，则验证该应用的U6验证引物。
确保所有慢病毒辅助质粒（所有质粒见第三部分）也已准备好，或者如果需要更大的sgrnas准备：
1. 无菌地将甘油储存在氨苄西林琼脂板上，在37℃的小培养箱中培养过夜。
2. 从培养皿中分离出一个菌落（不超过一天或两天），并用100-200毫升2xyt+氨苄青霉素肉汤接种到1-2升通风折流烧瓶中。在37℃下孵育过夜，在一个大型培养箱中以250转/分的速度振荡眼眶。
3. 使用purelink hipure质粒过滤器midiprep/maxiprep试剂盒按照制造商的说明进行准备。在te缓冲液和等份质粒中洗脱。
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第二部分：维持HEK293T细胞用于慢病毒生产

材料和试剂

吸管（Rainin，目录号：17014415和17014393）
吸管头（Denville，目录号：1159M43、1159M40、1159M42；Rainin，目录号：30389274）
无菌真空过滤装置：250毫升漏斗；聚偏氟乙烯膜；250毫升接收器；孔径：0.22微米（Fisher，目录号：SCGVU02RE）
猎鹰组织培养处理的烧瓶：开口盖；斜颈；生长面积：75平方厘米；250毫升（Fisher，目录号：13-680-65）
Thermo Scientific NUNC EasyFlaks：过滤帽，细胞培养处理，225平方厘米；70毫升工作容积（Fisher，目录号：12-565-221）
15ml锥形管
高压灭菌一次性硼硅酸盐玻璃巴斯德吸管：长度5.75（Fisher，目录号：13-678-20B）
HEK293T细胞（ATCC，目录号：CRL-3216）
1X DPB（Thermo Fisher，目录号：14190144）
含酚红的胰蛋白酶EDTA（0.25%）（Thermo Fisher，目录号：25-200-056）
70%乙醇
HEK293T介质（见配方）
1. 10%容积FBS美国原产地（生物流体技术，目录号：200-100-Q）
2. DMEM，高糖，丙酮酸（Thermo Fisher，Gibco，目录号：11-995-081）
3. 100x青霉素链霉素（10000 U/ml）（赛默飞世尔，目录号：15-140-122）

设备

血细胞仪（sigma-aldrich，型号：z359629-1ea）
二级生物安全柜（Nuaire，型号：NU-425-400）
湿度、温度和co2-控制培养箱（Thermo Forma系列II水套式co2培养箱，设置在37°C，5%co2）
水浴设置为37°C（Fisher Scientific，型号：ISOtemp 210）
带摆动斗转子的离心机，可容纳50毫升锥形管（Eppendorf，型号：5810R）
汽相内带小瓶储存盒的液氮杜瓦瓶（Thermo，目录号：316376）

程序

恢复细胞
1. 将11毫升HEK293T培养基放入T75烧瓶中，并放入培养箱中以加热并平衡pH值。此外，将10毫升HEK293T培养基加热至37°C。
2. 通过在37°C水浴中用70%乙醇预浸组织握住瓶盖，直到一个或两个小冰晶保留（2分钟或更少），快速恢复保存在杜瓦中的一小瓶HEK293T细胞。用70%乙醇对小瓶进行消毒，然后转移到生物安全柜，并在罩内工作，以完成方案的其余部分。
3. 将所有细胞溶液（通常为1毫升）转移至15毫升锥形管中，并用HEK293T介质（通常为9毫升）稀释10倍。
4. 以300x g的速度将细胞离心在摆动桶转子中3分钟。去除上清液并在1毫升加热的HEK293T培养基中重新培养。用血细胞仪计数细胞。
5. 在含有T75烧瓶的培养基中培养约280万个细胞。通过前后左右移动烧瓶而不摇晃烧瓶，将电池均匀地分布在烧瓶区域上。
6. 每天检查细胞的汇合情况，但播种这种密度可能会导致细胞在播种后48小时左右准备分裂。
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分裂/传代细胞
1. 每天检查细胞，直到细胞60-75%汇合，然后分裂/传代。hek细胞的健康状况对病毒滴度至关重要。不要分裂汇合度超过80%的细胞，一般不使用超过25代的细胞。此外，不要使用生长不均匀或有任何视觉形态变化的细胞。
2. 将11.5毫升HEK293T培养基放入T75烧瓶中，并放置在培养箱中以加热并平衡pH值。此外，将5毫升1x DPBS、10毫升HEK293T培养基和2.5毫升0.25%胰蛋白酶EDTA加热至37°C。
3. 吸出培养基，轻轻地将加热的DPB添加到烧瓶中以清洗细胞。吸入dpbs并加入胰蛋白酶。
4. 轻轻摇动烧瓶，直到所有细胞分离，通常不到一分钟。
5. 加入5毫升加热的HEK293T培养基，停止胰蛋白酶反应。将细胞转移至15ml锥形管中，并在300x g下，在摆动桶转子中离心细胞3分钟。去除上清液，并在5ml加热的HEK293T培养基中重新培养。用血细胞仪计数细胞。
6. 在含有T75烧瓶的培养基中培养约280万个细胞。在不摇晃烧瓶的情况下，通过向上/向下和左右移动烧瓶，将电池均匀地分布在烧瓶区域上。
7. 每天检查细胞的汇合情况，但接种这种密度可能会导致细胞在接种后48小时左右准备分裂。为使细胞在大约72小时后准备分裂，播种100万个细胞。
  注：这些数字是一个准则。仔细观察HEK293T系列的增长速度，并进行相应的调整。
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第三部分：小型慢病毒包装

建议使用这种小规模慢病毒制剂在体外对靶基因的sgrna有效性进行验证。它将产生足够的慢病毒，在培养物中有效地转化约375000个原代大鼠神经元。图2概述了小规模和大规模病毒生产的概况。 < BR>
图2。小型和大型慢病毒生产制剂概述

材料和试剂

吸管（Rainin，目录号：17014415和17014393）
吸管头（Denville，目录号：1159M43、1159M40、1159M42；Rainin，目录号：30389274）
Denville细胞培养板：带盖的12孔板（Thomas Scientific，目录号：1156D99）
1.5毫升聚丙烯微离心管（Fisher，目录号：21-402-901）
质粒：
1. 如第一部分（转移质粒）所述克隆的定制sgrna质粒（小规模的preps适合小规模的preps）
2. pcmv vsvg（addgene，目录号：8454）（仅限midi/maxi prepped）
3. pspax2（addgene，目录号：12260）（仅限midi/maxi prepped）
4. 如果需要，在EB或TE缓冲液中稀释质粒。
香菇-X浓缩器（Takara Bio，目录号：631231）
富根HD（Promega，目录号：E2311）
OPTI MEM I降低血清培养基（THEMOFISHER，目录号：31985070）
Dulbecco磷酸盐缓冲盐（DPBS）（Gibco，目录号：14190136）
10%氯漂白剂（clorox）
TE缓冲器（Thermo Fisher，目录号：12090015）
EB缓冲区（侨根，目录号：19086）
慢病毒生产介质（见配方）
1. 无血清L-谷氨酰胺的无血清培养基（Fisher，目录号：12725F）
2. L-谷氨酰胺（200mm）（赛默飞世尔，目录号：25030149）
3. 7.5%w/v碳酸氢钠（Fisher，目录号：S233-500）
4. 100毫米丙酮酸钠（Lifetech，目录号：11360070）

设备

台式制冷离心机（Eppendorf，型号：5424R）
荧光显微镜（Nikon Ti-Sr）
湿度、温度和co2-控制培养箱（Thermo Forma系列II水套式co2培养箱，设置在37°C，5%co2）

程序

转染前一天，将每孔400K HEK293T细胞置于12孔板中，并加入1毫升HEK293T培养基。
当HEK293T细胞约80-95%汇合时，准备转染。每口井加热1毫升制备好的慢病毒生产介质。这些细胞通常在电镀后24小时内即可转染。
让富金在室温下达到平衡，并短暂搅拌。解冻质粒。无菌转移50微升optimem到1.5毫升聚丙烯管中，用于每个待转染的孔。
将350ng的sgrna质粒、250ng的pcmv-vsvg和400ng的pspax2加入到已校准的optimem和vortex中混合。
向下旋转质粒溶液，然后将3微升的fugene直接添加到液体的中间，当fugene与塑料发生反应时，不要沿着试管的一侧向下移动。轻轻搅动反应。
孵育反应10分钟。孵育时，在HEK293T细胞上轻轻吸出培养基，并更换为每孔1毫升加热慢病毒生产培养基。
向井中加入完全的反应，轻轻地混合，将盘子前后移动，左右移动。
将转染反应在细胞上孵育40-48小时。从这一点开始，培养板包含有活性复制缺陷的慢病毒颗粒。遵守所有BSL-2指南或贵机构概述的指南。在处理前，用10%氯漂白剂浸泡30分钟，对所有与病毒接触的材料进行消毒。
对于sgrnas，如果需要，用荧光显微镜验证mcherry的表达。
将培养基放入1.5毫升微型离心管中，并在2300x g下离心5分钟，以获得颗粒碎屑。
避免管底部的碎屑颗粒，去除900微升上清液并放入新管中。
加入300微升LENT-X浓缩器，盖上盖子，轻轻倒置混合。
注：透镜X浓缩器非常粘稠，吸管缓慢。
在4℃下孵育6h至过夜。样品必须彻底冷却。
将微型离心机冷却至4°C。在1500x g下离心每个慢病毒45分钟，使慢病毒颗粒化。
在不干扰慢病毒颗粒（可能看不见）的情况下，小心地去除所有上清液，并通过温和的移液管在10微升冷1X无菌DPB中重新培养。避免制造气泡。
让慢病毒在转化前再培养6小时到一夜。这种病毒足以在培养物中有效地转化375000个原代大鼠神经元。
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第四部分：大规模慢病毒包装

这种大规模慢病毒制剂被推荐用于使sgrna和dcas9 vpr慢病毒在体外和体内同时使用。利用该方案，我们常规获得150-450微升的sgrna病毒的&gt；5 x 1011gc/ml（基因组拷贝数/ml）和dcas9 vpr病毒的&gt；1 x 1011gc/ml用于体外使用。对于体内，我们通常产生30-50微升的&gt；1 x 1012gc/ml用于sgrna病毒，以及&gt；5 x 1011gc/ml用于dcas9 vpr病毒。该方案改编自公开的慢病毒方案（合成神经生物学组，2009年）。

材料和试剂

吸管（Rainin，目录号：17014415和17014393）
吸管头（Denville，目录号：1159M43、1159M40、1159M42；Rainin，目录号：30389274）
超离心管；薄壁；38.5毫升；25 x 89毫米（贝克曼库尔特，目录号：344058）
超离心管；薄壁；13.2毫升；14 x 89毫米（贝克曼库尔特，目录号：344059）
50ml锥形管
0.45微米过滤单元
猎鹰组织培养处理的烧瓶：开口盖；斜颈；生长面积：75平方厘米；250毫升（Fisher，目录号：13-680-65）
Thermo Scientific NUNC EasyFlaks：过滤帽，细胞培养处理，225平方厘米；70毫升工作容积（Fisher，目录号：12-565-221）
EMD Millipre Millex HP过滤器单位：孔径：0.45微米；过滤器直径：33毫米（Fisher，目录号：SLHP033RB）
bd通用注射器：leur-lock；体积：30ml（fisher，目录号：22-124-969）
HEK293T细胞
OPTI MEM I降低血清培养基（THYMO Fisher，目录号：31985070）
质粒：
1. 如第一部分所述克隆的定制sgrna质粒（转移质粒）
2. 小扁豆syn-flag-dcas9-vpr（addgene，目录号：114196）（转移质粒）
3. PCMV VSVG（地址：8454）
4. PSPAX2（地址：12260）
5. 必要时在EB或TE缓冲液中稀释质粒
富根HD（Promega，目录号：E2311）
Dulbecco磷酸盐缓冲盐（DPBS）（Gibco，目录号：14190136）
Lenti-X QRT PCR滴定试剂盒（Takara，目录号：631235）
TE缓冲器（Thermo Fisher，目录号：12090015）
EB缓冲区（侨根，目录号：19086）
慢病毒生产介质（见配方）
1. 无血清L-谷氨酰胺的无血清培养基（Fisher，目录号：12725F）
2. L-谷氨酰胺（200mm）（赛默飞世尔，目录号：25030149）
3. 7.5%w/v碳酸氢钠（Fisher，目录号：S233-500）
4. 100毫米丙酮酸钠（Lifetech，目录号：11360070）

设备

-80°C冷冻柜（Thermo Fisher Scientific，型号：UXF60086A63）
带适当转子和管托的超离心机（Beckman Coulter，型号：Optima L-100K，带SW32和SW41转子的超离心机）
台式制冷离心机（Eppendorf，型号：5424R）
荧光显微镜（Nikon Ti-Sr）

程序

转染前48小时，每T75培养约330万HEK293T细胞，每t225培养约1000万细胞。
注意：确保细胞均匀分布在烧瓶上，如果生长不均匀，请勿使用。
当HEK293T细胞约80-95%汇合时，准备转染。热制备慢病毒生产介质。
t75:13毫升
t225:33毫升
让富金在室温下达到平衡，并短暂搅拌。解冻质粒。无菌地将optimem转移到聚丙烯锥形管中，以供每个待转染的烧瓶使用。
T75:1.5毫升
t225:4.5毫升
向optimem、vortex和spin down添加质粒（仅准备了midi/maxi）：
T75:9微克转移质粒、6微克PCMV-VSVG和9微克PSPAX2
t225:27μg转移质粒、18μg pcmv-vsvg和27μg pspax2
注：
1. 可以为每个转移质粒计算摩尔比，但这些量似乎对大多数结构物有效。
2. 转移质粒为sgrna或dcas9 vpr质粒。
向下旋转质粒溶液，然后将fugene直接添加到液体的中间，当fugene与塑料发生反应时，不要沿着试管的一侧向下移动。轻轻搅动反应。
T75:65微升
t225:200微升
孵育反应10分钟。孵育时，在HEK293T细胞上轻轻吸出培养基，并更换为每孔1毫升加热慢病毒生产培养基。
注意：在这个汇合处，细胞很容易分离。轻轻地添加培养基，方法是倾斜烧瓶，并将培养基沿着不含细胞的一侧缓慢运行。
向烧瓶中加入完全反应物，并通过前后和左右移动板轻轻混合。
将转染反应在细胞上孵育40-48小时。从这一点开始，培养板包含有活性复制缺陷的慢病毒颗粒。< BR> 注意：遵守所有BSL-2指南或贵机构概述的指南。在处理前，用10%氯漂白剂浸泡30分钟，对所有与病毒接触的材料进行消毒。
将超离心机、转子和管架预冷至4°C。清洁管架并使其彻底干燥。
对于sgrnas，如果需要，用荧光显微镜验证mcherry的表达。
将培养基放入50毫升锥形管中，并在2300x g下离心5分钟，以获得颗粒碎屑。
从注射器上取下柱塞，为每种病毒将0.45μm过滤装置组装到30 ml注射器上，并将超离心管放入生物安全罩中。
避开试管底部的碎屑颗粒，去除上清液并放入超离心管上方的注射器中。更换柱塞并缓慢地将上清液通过过滤装置。
T75:12毫升，用于贝克曼344059试管
t225:36毫升，用于贝克曼344058试管
注：
1. 将超离心管充满到大约90%是至关重要的，否则它们在旋转过程中会坍塌。
2. 如果以后需要旋转，可以将试管密封，并在4°C下保存几个小时。
称量试管重量，并用准备好的慢病毒生产介质调整质量，确保所有试管彼此之间的重量在0.2g以内。
将管放入管托中，将管托安装在转子中，然后放入超离心机中。在106883x g（25000转/分）下，用真空在4°C下旋转1.75小时。将转子设置为最大加速度和慢速减速。
准备一瓶10%漂白剂。旋转完成后，将试管架放入生物安全罩中，并将上清液倒入漂白剂中。保持试管翻转，使用Kimwipe去除任何残留上清液。不要碰管子底部的小球。
在1X dpbs中重新悬浮颗粒，轻轻吸管混合，避免产生任何气泡。紧密密封管，使颗粒在4°C下过夜。
T75:150微升，用于体外
t225:450微升用于体外；30-50微升用于体内
注意：如果需要的话，根据你想要的GC/ML和预期的产量来调整体积，但是这些体积通常对SGRNA和DCAS9 VPR慢病毒都有效。如果需要更高的效价，可以在再悬浮期间组合多个培养板以增加GC/ML。
第二天，将微型离心机预冷至4°C。将所有上清液转移至冷冻的1.5毫升微型离心管中，并在2300x g下离心5分钟至颗粒碎屑。
避开颗粒，将上清液转移到新的200微升离心管中。将病毒分成至少10微升/份的一次性小瓶
降速一次性等份，在干冰上速冻。储存在-80°C下。
注意：如果病毒储存在冷冻室内的盒子里，并在进入时迅速放在干冰上，我们至少一年没有发现病毒滴度显著下降。
以1X dpbs中连续稀释的1微升病毒作为试剂盒的150微升输入，使用透镜-X qrt-pcr滴定试剂盒获得gc/ml滴度。
< BR>

第五部分：体外原代细胞培养的转导

材料和试剂

吸管头（Denville，目录号：1159M43、1159M40、1159M42；Rainin，目录号：30389274）
50ml锥形管（费希尔，目录号：14-959-49A）
初级神经元及其神经介质
注：原代神经细胞培养可采用多种既定方案制备。我们使用savell等人，2019中描述的培养物制剂。

设备

吸管（Rainin，目录号：17014415和17014393）
湿度、温度和co2-控制培养箱（Thermo Forma系列II水套式co2培养箱，设置在37°C，5%co2）

程序

多重感染（moi）为1000的转导对sgrna和dcas9 vpr结构都有效，但我们在较低的moi上也取得了成功。计算转导所需的病毒体积。原代神经元接种后3-5天应进行转导。我们的标准程序涉及将125000个原代神经元的SGRNA和DCAS9 VPR慢病毒的MOI 1000转导到24孔板的每个孔中（savell等人，2019年）。
1. 我们还没有完全测试不同比例的sgrna:dcas9 vpr，发现1:1的效果似乎很好。对于某些基因靶点，两种病毒的moi增加导致转录增强，因此您可能需要尝试一系列moi以获得所需的基因诱导水平。
2. 如果多路复用，则为每个sgrna病毒添加相等的moi。你也可以添加一个更高的DCAS9VPR慢病毒的MOI来解释每一个基因，但我们还没有彻底的测试。包括增加MOI非靶向对照（我们推荐细菌lacz基因）。
  示例：如果一次瞄准2个基因，则每个基因特异性sgrna的moi为1000，dcas9 vpr的moi为1000-2000。将非靶向控制的MOI转换为2000，以解释汇集SGRNA病毒的原因。
从每个孔中取出大约55%的原代神经元培养基并放入试管中。保存在细胞培养箱中直到以后。
用移液管将预定体积的病毒导入培养孔，直接导入剩余的培养基中。轻轻搅拌并放回培养箱。
八到十二小时后，准备并加热神经元培养基。< BR> 注：
1. 计算足够的培养基，使其在井内以80%的原始神经元培养基体积洗涤。
2. 计算足够的培养基，用半新鲜的神经元培养基代替。
吸出细胞上的培养基（含有病毒）并立即（但轻轻）加入神经元培养基清洗液。
吸出清洗液并添加50%新鲜介质，然后将步骤2中移除的50%条件介质重新添加。
在提取rna和测量基因表达变化之前，让构建物至少表达5-7天。< BR> < BR>

第六部分：成年神经元在体内的传导

材料和试剂

sgrna和dcas9 vpr慢病毒的大规模生产（t225）
微升和气密神经注射器（汉密尔顿，目录号：7653-01）
1个DPB（Thermo Fisher，产品目录号：14190144）

程序

首先，在体外验证一个基因特异性sgrna成功地诱导了你感兴趣的基因（见第五部分）。
在t225中为每个构建物生产大规模慢病毒制剂，并仅在30-50微升无菌1x dpbs中再培养。
如上所述对病毒进行滴度测定，必要时用1倍无菌dpbs稀释sgrna病毒，使研究中使用的所有sgrna的滴度相同。
以0.25微升/分钟的速率将SGRNA和DCAS9 VPR构建物的混合物注入感兴趣的大脑区域。在我们的研究中，我们使用总体积为1.5微升，将0.5微升SGRNA质粒与1.0微升DCAS9 VPR混合。
转基因在大鼠输注后2周的表达已被证实。

食谱

2xyt氨苄青霉素肉汤（每升）
16克胰蛋白胨
10g酵母提取物
5g氯化钠
将ph值调整到7.0
1. 高压灭菌并冷却至室温
2. 溶液冷却至室温后，无菌添加100微克/毫升氨苄西林
3. 在4°C下储存1个月
HEK293T介质
gibco dmem，高糖，丙酮酸
10%热灭活fbs
1个青霉素链霉素（100 U/ml）
1. 10%体积FBS US来源，在制备培养基之前，立即在50℃下热灭活30分钟
2. 在dmem中加入1%体积的pen-strep[100x青霉素链霉素（10000 u/ml）]和10%体积的fbs制备培养基
3. 无菌过滤器，在4°C下保存一个月。避光
慢病毒生产介质（每次新鲜）
无血清L-谷氨酰胺无血清培养基< BR/> 2毫米L-谷氨酰胺
1毫米丙酮酸钠
1. 在不含L-谷氨酰胺和无菌滤液的超培养无血清培养基中加入谷氨酰胺、碳酸氢钠、丙酮酸钠原液，加入1/100倍量的培养基，制备培养基；
2. 每次转染前避光并准备新鲜
库存解决方案：
1. 200mm L-谷氨酰胺
2. 100毫米丙酮酸钠
3. 7.5%（w/v）碳酸氢钠：每100毫升水溶解7.5克，用无菌过滤器过滤，制备7.5%的溶液。

致谢

我们要感谢所有现在和过去的日间实验室成员，他们对如何改进这些协议提出了有益的建议。

相互竞争的利益

作者没有竞争利益要披露。

伦理学

所有涉及动物受试者的实验程序均由伯明翰阿拉巴马大学的机构动物护理和使用委员会批准。所有涉及有害物质的实验程序均由伯明翰阿拉巴马大学职业健康与安全生物安全委员会批准。

工具书类

查韦斯，A.，谢曼，J.，沃拉，S.，普鲁伊特，B.W.，塔特尔，M.，伊耶尔，P.R.，林，S.，基亚尼，S.，古兹曼，C.D.，威根，D.J.，特奥瓦内斯扬，D.，布拉夫，J.L.，戴维索恩，N.，霍斯登，B.E.，佩里蒙，N.，韦斯，R.，亚奇，J.，柯林斯，J.J.和丘奇，G.M.（2015）。高效cas9介导的转录编程。nat方法12（4）：326-328。
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