材料和试剂

文化C。（我们使用来自莫斯科植物生理学研究所微藻类集合的菌株IPPAS D-298）</em> 137mt +
在兔子中针对感兴趣的蛋白质产生的一抗（我们使用针对莱茵衣藻的重组Cah-3蛋白（α-CA）的抗体，Agrisera，Vannas，Sweden）
二抗：与10nm胶体金颗粒缀合的抗兔IgG（Sigma-Aldrich，目录号：G7402）
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
LR白包埋试剂盒（Sigma-Aldrich，目录号：62662-1EA-F）
明胶胶囊（SPI供应品，目录号：02308-SS）
Formvar和碳涂层镍网（SPI供应，目录号：3430N-CF）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A7906）
山羊血清（Sigma-Aldrich，目录号：G9023）
兔血清（Sigma-Aldrich，目录号：R4505）
多聚甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：P6148）
乙醇
可选
乙酸铀（如 SPI Supplies，目录号：02624-AB）
柠檬酸铅（ Sigma-Aldrich，目录号：15326）
NaOH
磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）（参见配方）
固定溶液（4％多聚甲醛）（参见配方）
Tris缓冲盐水（TBS）（pH 7.4）（见Recipes）
1％BSA-TBS（见配方）
醋酸铀（见配方）
柠檬酸铅（参见配方）

设备

96孔免疫板（例如Greiner Bio-One，目录号：650001）。
带细尖的巴斯德移液器（ROTHE 306.1）
至少具有37-55°C温度范围的温控器（ BINDER B28）
超薄切片机（例如 Reichert，OMU-3，奥地利）
网格存储箱（Sigma-Aldrich，目录号：G6276）
透射电子显微镜（例如，Libra-120，Carl Zeiss，Germany）
塑料培养皿或具有疏水表面的聚四氟乙烯板
湿室

程序

样品制备：
旋转 C的样本。在2ml Eppendorf管中在室温下以13,000×g离心5分钟。所获得的丸粒的最佳体积为足以包埋在2-3个明胶胶囊中的大约50-75μl。
固定：
除去上清液，加入0.5ml固定液（4％多聚甲醛）。为了正确固定，在4℃下的最小培养时间为3小时。
注意：固定的时间可以延长达数天。这种固定溶液保存膜和大多数蛋白质，但它可能在几周的储存后脱离淀粉和蛋白质。
嵌入（所有步骤在室温下进行）：
1. 在相同的Eppendorf管中用PBS缓冲液洗涤沉淀：
  用移液管除去上清液。
  加入1ml PBS缓冲液，轻轻涡旋孵育5分钟。
  按照步骤1中的说明进行操作。
  重复该洗涤步骤3次。
2. 脱水颗粒用乙醇稀释系列，每种乙醇浓度两次：
  20％（v/v）15分钟+ 15分钟
  40％（v/v）15分钟+ 15分钟
  50％（v/v）20分钟+ 20分钟
  70％（v/v）20分钟+ 20分钟
  对于每个脱水步骤，丢弃先前的溶液，并用干净的移液管加入0.5ml的下一个顺序溶液。孵育指定的时间。我们建议使用在4°C预冷的新鲜制备的溶液。在这些步骤中小心不要接触或干扰沉淀。
  注意：我如果团块受到干扰，按照步骤1所述离心Eppendorf管。如果在此步骤有必要中断程序，样品可以在4℃下在70％乙醇中保存过夜。
3. 渗透：用70％乙醇和LR白色树脂的混合物依次代替70％乙醇：
  3：1 70％乙醇：LR白色1小时
  1：1 70％乙醇：LR白色1小时
  1：3 70％乙醇：LR白色1小时
  接下来的步骤需要用LR White树脂完全代替乙醇：
  用LR White树脂单独代替1：3乙醇/树脂混合物1小时用新鲜的LR White树脂再次更换，并留置过夜。
  第二天用LR White树脂的新部分替换它，并保留用于嵌入注意：LR White树脂应根据制造商的方案在使用前与催化剂混合24小时。随着时间的推移，树脂 - 乙醇混合物可以分层成层。如果发生这种情况，用移液管轻轻混合几次（注意不要损伤沉淀）。
4. 嵌入：
  将明胶胶囊放入96孔免疫板的孔中在每个明胶胶囊中加入一滴树脂。
  将一小片颗粒放入胶囊中 - 一颗颗粒通常进入2-3粒用树脂填充胶囊。避免溢出。小心地用盖子盖住胶囊。
  在37℃孵育1-4天（或在45℃孵育一天），然后在55℃孵育直至聚合完成（通常1-3天）。
  注意：在较低温度下较长的温育有助于接受较软的块，较高温度下较短的温育有助于接受更坚固的块，但更脆弱。可以用针检查聚合的完全性：树脂应该是固体但不易碎。
5. 用切片机将样品切成切片，并将其放在Formvar和碳涂覆的镍网上注意：Formvar +碳涂层可防止非特异性标记，并提高切片的质量（无碳层部分经常起皱）。
免疫细胞化学
用疏水表面（例如，塑料培养皿或特氟隆板）上的50-100μl液滴的表面上的网格进行所有以下操作。
提示：为了使网格表面与溶液更好地相互作用，将疏水表面上的液滴和网格放在由于涡旋振动轻微颤抖的桌子上。调整振动的强度，以便液滴表面的颤抖将是明显的。
当需要过夜培养栅格时，将其放入4℃的湿室中。在后续步骤中不允许网格变干。
1. 阻断抗体在BSA-TBS中的20％山羊血清的滴的非特异性相互作用1小时注意：如果仍然发生非特异性标记，请将山羊血清高达50％和BSA高达5％的比例增加。
2. 将网格放在100微升滴与适当稀释的一抗针对目标蛋白质。稀释度可以仅凭经验确定;通常在1:16 - 1：128的范围内。
  对于阴性对照，将兔血清或更好地，预免疫血清而不是一抗施用于靶蛋白将纯化的目标蛋白加入作为阳性对照的一抗的溶液中离开网格过夜在4℃。您可以改变时间和温度以增加或减少结合的效率和标签的强度
3. 用TBS洗涤滴液上的网格5次，在TBS溶液的更换之间保持滴液5-10分钟
4. 将网格转移到100微升适当稀释（根据制造商的协议）的抗兔IgG与BSA-TBS中的10nm胶体金颗粒缀合并在室温下暴露1小时。
5. 用TBS洗涤网格，用TBS洗涤5次，然后用去离子水洗涤。这些洗涤步骤应通过在1分钟内快速重复地将网格浸入3-5ml TBS和水中来进行。
6. 干滤网放在滤纸上，放入网格储存箱
7. 可选 - 依次将网格与乙酸铀酰和柠檬酸铅对比。用NaOH晶体和用0.2M NaOH润湿的滤纸制备湿室（图1）。将网格放在100微升醋酸双氧铀滴45-60分钟。倒入50μl的柠檬酸铅到同一板。通过快速反复浸没到3-5ml的0.2M NaOH（5-10次），然后 - 3-5毫升煮沸的去离子水（1分钟）洗涤网格。需要NaOH溶液和沸水以避免CO 2与铅的反应，这导致不溶性晶体的形成。将网格放在制备的柠檬酸铅滴5-7分钟。以与在乙酸铀酰之后进行的相同的方式洗涤。干滤网放在滤纸上，放入网格储存箱中。
用电子透射显微镜分析切片注意：在阴性和阳性对照中，只允许有少量金颗粒作为背景。

图1.湿室用NaOH晶体进行对比染色

食谱

磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）
1. 准备储备溶液：
  储液1：NaH 2 PO 4 4.76g/100ml
  储备液2：Na 2 HPO 4 14.2g/500ml
2. 对于0.5L PBS缓冲液，混合95ml的储备液1和405ml的储液2，并加入
  4.25g NaCl（终浓度为0.85％）此溶液的pH应为7.4（可用NaOH调节）
固定溶液（4％多聚甲醛）
1. 将50ml PBS（pH7.4）加热至70℃
2. 在热PBS中搅拌溶解2g多聚甲醛
3. 在室温下冷却溶液，并通过滤纸
  过滤（保持溶液在4°C在黑暗中，使用1周内）
Tris缓冲盐水（TBS）（pH7.4） Tris-HCl 2.4g/L
NaCl 8.76g/L
用HCl
调节pH至7.4
1％BSA-TBS
向TBS中加入10 g/L的BSA
保持等分试样冷冻在-20°C，或使用新鲜。
乙酸乙烯酯
制备乙酸铀酰在50％乙醇中的饱和溶液。通过滤纸过滤。使用新鲜。
柠檬酸铅
1. 将1.33g的Pb（NO 3）2和1.76g的Na 3（C 6 H 5）在30ml去离子水中的溶液中，加入10％氢氧化钠水溶液。在轨道振荡器中摇动30分钟。在这个阶段，解决方案可能显得乳白色
2. 加入8ml 1M NaOH：溶液应变得透明。调整用去离子水将体积调节至50ml。 pH应该约为12.
  保持小等分在-20°C。使用前解冻和旋转。

致谢

该方案改编自Sinetova等人（2012）。我们赞赏J.Moroney教授（美国路易斯安那州立大学）提供C的应变。我们为我们提供了针对重组Cah3和Cah3-MBP融合蛋白的一级抗体。我们感谢Pronina N.A.教授和Kupriyanova E.V.博士为本方案的生理和分子生物学基础。这项工作是由俄罗斯基础研究基金会（第10-04-01463号），俄罗斯科学院院长授予的资金（方案"分子和细胞生物学"）和俄罗斯的拨款教育和科学部（16.740.11.0176）。

参考文献

Oliver，C。（2010）。嵌入标签方法。 Methods Mol Biol 588：387-395。
Reynolds，E.S。（1963）。在高pH下使用柠檬酸铅作为电子显微镜中的电子不透明染料。 J Cell Biol 17：208-212。
Sinetova，M.A.，Kupriyanova，E.V.，Markelova，A.G.，Allakhverdiev，S.I.and Pronina，N.A。（2012）。碳酸酐酶Cah3在灵芝衣藻类囊体膜中的鉴定和功能作用/em> 。 Biochim Biophys Acta 1817（8）：1248-1255。