材料和试剂

75 cm2组织培养瓶（Greiner Bio One，目录号：658170）
2和10毫升塑料移液管（Sigma-Aldrich，目录号：CLS4101）
吸管头，吸管工，PK1000（格兰杰，目录号：52JY20）
InvitrogenTMCountessTM细胞计数室玻片（Thermo Fisher Scientific，Invitrogen，目录号：C10312）
上皮细胞系caco2-bbe或c2bbe1（atcc，目录号：atcc？htb-37tm）
DMEM（1:1）1X培养基（赛默飞世尔科学公司，Gibco，目录号：12634010）
胎牛血清（FBS）56℃热灭活（亚特兰大生物制品，目录号：S1050H）
青霉素链霉素（PEN/STREP）（赛默飞世尔科学公司，Gibco，目录号：15140122）
磷酸盐缓冲盐（PBS 1X）（赛默飞世尔科学公司，Gibco，目录号：10010049）
0.25%胰蛋白酶EDTA（1x）（赛默飞世尔科学公司，Gibco，目录号：25200056）
invitrogentm台盼蓝染色（0.4%）（赛默飞世尔科学公司，invitrogen，目录号：T10282）
重组人IL-22蛋白（研发系统，目录号：782-IL10）
细胞培养基（见配方）
IL22库存（见配方）

设备

Pipetman Classic p1000（Gilson，目录号：FA10006M）
Drummond Scientific Pipet Aid？便携式xp w/110 V充电器（Drummond Scientific，目录号：4-000-100）
层流罩（LabgardⅡ级A2型生物安全柜，Nuaire，型号：NU-540）
Thermo Scientific 3110 co2水套培养箱（Thermo Fisher Scientific，型号：4120）
数字水浴（VWR89501-460）
尼康日食TS100倒置显微镜（尼康，型号：日食TS100）
伯爵夫人TM自动细胞计数器（赛默飞世尔科学公司，因维创，目录号：AMQAF1000）
ECIS Zθ（θ和16 W阵列站（应用生物物理，https://www.biophysics.com/products.php）（图1）
紧凑型组织培养箱（SHEL实验室，型号SCO5A）（图1）
8W10E+文化软件（IBIDI，目录号：72001）（图2）
Optiplex 7760一体机（6核/9MB/6T/最高4.1GHz/65W）（戴尔）
< BR>
图1。ECIA ZQ（θ）和16W阵列站（在紧凑型组织培养箱内）

图2。8个井阵列“8w1e”。8个井中的每个井都包含一个直径为250μm的圆形活性电极（蓝色箭头末端的点）。每口井的基底面积为0.8 cm2，最大体积为500μl。
< div > < BR>

软件

ECIS Z软件（https://www.biopphysics.com/products-ecisz0.php“target=”\u blank“>https://www.biopphysics.com/products-ecisz0.php）
Microsoft Office Excel（Microsoft）

程序

在含有10%灭活胎牛血清（FBS）和1%青霉素链霉素的DulbCo改性EGO培养基（DMEM）培养基中，常规保存CACO-2-BBE细胞，并置于37℃的细胞培养箱中，在5% Co＞2＜/SUB>和90%湿度。
在倒置显微镜下观察75 cm2烧瓶中CaCO2 BBE细胞的融合（Nikon Eclipse TS100）（图3）。
< BR>
图3。75 cm2烧瓶中汇合CaCO2-BBE单层的显微照片。放大倍数：10倍。
< BR>
在层流罩下，用PBS 1X（每次3次，每次5毫升PBS）冲洗含有CaCO2 BBE细胞的75 cm2烧瓶。
加入2毫升0.25%胰蛋白酶EDTA。
将含有CaCO2 BBE细胞的75 cm2烧瓶（含2 ml 0.25%胰蛋白酶EDTA）放入细胞培养箱中5分钟。
倒置显微镜（Nikon Eclipse TS100）观察细胞分裂。
如果分离良好，向烧瓶中加入10毫升DMEM，并添加10%FBS和1%P/S培养基，使胰蛋白酶失活，然后上下彻底移液（使用2毫升塑料移液管），以打破细胞团。
将75 cm2的含有CaCO2-BBE细胞的烧瓶置于倒置显微镜下（Nikon Eclipse TS100），观察CaCO2-BBE细胞为单细胞悬浮液（无细胞团）。如果没有，请返回步骤7。
使用invitrogen countesstm自动计数器对细胞计数。CountessTM自动细胞计数器是一种台式计数器，设计用于精确测量细胞计数和存活率（活细胞、死细胞和总细胞），使用标准台盼蓝技术。
将每孔0.3x 106的caco2-bbe细胞板成两个8w10e+培养液阵列，培养基体积为500μl/孔（一个阵列包含8个孔）。
ECIS阵列站中的2个培养皿（16口井）允许观察者使用适当的控制设计重复/三倍的实验。
将2个培养液放入ECIS阵列中，该阵列包含培养箱站内的CaCO2 BBE细胞（见图4），然后关闭培养箱门。培养箱设置在37°C、5%CO2和90%湿度下。
< BR>
图4。孵化器内ECIS阵列站的两个培养软件 < BR>
选择“8w10e”以及配置。
单击“设置”按钮以验证阵列是否正确连接到系统（图5）。
< BR>
图5。ECIS软件和测量上皮电阻（R）的设置程序。选择“8W1E”和井阵列（1），选择“支架A和支架B”（1）中的所有井，单击“设置”按钮（2）检查阵列是否正确连接到系统。连接到系统的井显示绿色（1）。选择“单频”（3）作为500赫兹（4），然后单击“开始”（5）并指定数据的存储位置。实验通讯可以记录下来（6）。
< BR>
连接到系统的井显示绿色（图5）。未连接到系统的井显示红色。如果阵列图显示为红色，请稍微调整文化软件的位置，然后单击“检查”以确保文化软件的每个井都正确连接到系统。
选择“要测量的井”。
选择“单频”（对于CaCO2 BBE，最佳单频为500 Hz）（Charrier等人，2005年）（图5）。
间隔（秒）：取消选中。（最大数据采集）（图5）。
单击“开始”并指定数据的存储位置（图5）。
当CaCO2 BBE在生长20-30小时后达到融合时（电阻平台），检查“伤口/电穿孔设置”（图6）。
在“Well configuration”（油井配置）中选择“Wells to wind”（要缠绕的油井）（图6）。
选择“伤口时间”（30秒[图6]，CaCO2 BBE的最佳时间）（Charrier等人，2005年；Zhang等人，2016年；Xiao等人，2018年）。
选择“伤口电流”（1400μA[图6]，CaCO2-BBE的最佳值）（Charrier等人，2005年；Zhang等人，2016年；Xiao等人，2018年）。
选择“频率”（40kHz[图6]，CaCO2BBE的最佳频率）（Charrier等人，2005年；Zhang等人，2016年；Xiao等人，2018年）。
单击“激活”（图6）。
< BR>
图6。伤口到caco-2-bbe单层。在“井配置”（1）中选择“伤口/电穿孔设置”（2），选择“伤口”（3），选择“30秒”作为“伤口时间”（4），选择“1400μA”作为“伤口电流”（5），选择“40kHz”作为“伤口电流”。“频率”（6）并单击“激活”（7）。
< BR>
造成伤口后，确认R值降至接近无细胞电极的值。如果不是这样的话，重复伤痕。
将伤口敷于上皮后，可将治疗（药物添加）应用于指定的井，以评估添加药物的促愈合或抗愈合作用。
当愈合完成时，R返回到伤口前的阻力值，单击“完成”停止实验（图7）。
转到文件并选择“Export data”（导出数据）（图7）。
< BR>
图7。caco-2-bbe单层伤口愈合。愈合完成后，单击“完成”（1），转到“文件”（2），选择“导出数据”（3）。
< BR>
作为一个例子，我们已经证明（肖等人，2018年，图7），与未经治疗的损伤上皮层相比，经IL-22治疗的损伤上皮层（最终浓度为0、50和100 ng/ml）恢复率显著且呈剂量依赖性增加。这些结果清楚地表明，il-22可以促进损伤结肠上皮层的愈合。在另一项研究中（Charrier等人2005年的图6），我们已经证明，创伤后，CaCO2-BBE/ADAM-15细胞（CaCO2-BBE过度表达ADAM-15）的抵抗力并没有增加到非损伤细胞的抵抗力值（Charrier等人20年的图6a）。05）。相比之下，caco2-bbe/vect细胞的抵抗力（内源性adam-15在caco2-bbe中的表达）随着时间的推移而增加，并达到非损伤细胞的抵抗值（charrier等人2005年的图6a）。这些结果与实验结束时的观察结果相关，实验结束时，伤口在CaCO2 BBE/VECT细胞中完全愈合，但在CaCO2 BBE/ADAM-15细胞中无法愈合（Charrier等人2005年的图6b）。

数据分析

转到“文件”（图7），单击“导出数据”（图7），选择“所有数据”或“选定井/时间”（图6），选择“到Excel”或“图表数据”（图7）。
利用excel中的数据进行统计分析，建立实验图。

食谱

细胞培养基
DulbCo改性EGO培养基（DMEM）培养基中含有10%灭活胎牛血清（FBS）和1%青霉素链霉素（NBSP）；
IL22原液
10μg/ml细胞培养基

致谢

EV是来自克罗恩和结肠炎基金会的职业发展奖的获得者。该方案改编自charrier等人的公开工作。（2005），Zhang等人。（2016）和肖等人。（2018年）。

相互竞争的利益

作者声明在这部作品中没有利益冲突。

工具书类

Charlier，L.，Yan，Y.，Driss，A.，Laboisse，C.L.，Sitaraman，S.V.和Merlin，D.（2005）。ADAM-15抑制人肠上皮细胞单层的伤口愈合。AM J Physical Gastrointest Liver Physical288（2）：G346-353。
肖，B.，陈，Q.，张，Z.，王，L.，康，Y.，丹尼，T.和梅林，D.（2018）。口服靶向纳米粒联合白介素-22介导的肿瘤坏死因子α基因沉默，协同联合治疗溃疡性结肠炎。j对照释放287:235-246。
Zhang，M.，Viennois，E.，Prasad，M.，Zhang，Y.，Wang，L.，Zhang，Z.，Han，M.K.，Xiao，B.，Xu，C.，Srinivasan，S.和Merlin，D.（2016年）。食用生姜纳米粒：预防和治疗炎症性肠病和结肠炎相关癌症的新方法。生物材料101:321-340。