材料和试剂

消耗品
1. 吸管尖头
2. 冰桶
3. 微量加样器
4. 10ml注射器（bd，目录号：309604）
5. 18 g x 1针（bd，目录号：305195）
6. 50毫升锥形管（Denville，目录号：C1062-P）
7. FACS试管（圆形），无菌，带盖（康宁，Falcon，目录号：352054）
8. FACS管（圆形），非无菌，无盖
9. 单元过滤器，70μm（Fisherbrand，目录号：22363548）
10. 用于过滤培养基和facs缓冲液的0.22μm过滤器（sarstedt，目录号：83.1823.001）
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试剂
1. 超纯脂多糖，如前所述通过热酚法从大肠杆菌k235中纯化（McIntire等人，1967）
2. 未结合大鼠igg2a，λ抗鼠cd16/32（fc受体）抗体，克隆93（biolegend，目录号：101302）
3. pe结合抗小鼠cd284（tlr4）抗体，克隆sa15-21（biolegend，目录号：145404）
4. pe结合型同型对照抗体，大鼠igg2a，k，克隆rtk2758（biolegend，目录号：400507）
5. 可选：用于细胞鉴定的其他抗体（例如，Alexafluor结合抗鼠F480；BioLegend，目录号：123119）
6. 可选：多聚甲醛溶液（PFA），4%PBS（Affymetrix，目录号：19943）
7. 无菌生理盐水（巴克斯特，目录号：0338-0048-03）
8. 可选：ACK裂解缓冲液（Quality Biological，Inc.，目录号：118-156-721）
9. 无菌磷酸盐缓冲盐（PBS）（康宁，目录号：21-040-cv）
10. 培养基（见配方）
  1. RPMI 1640（康宁，目录号：15-040-cv）
  2. 胎牛血清（FBS）（亚特兰大生物制品，目录号：S11550）
  3. 青霉素/链霉素（Gibco，目录号：15140-122）
  4. L-谷氨酰胺（GIBCO，目录号：25030-081）
11. FACS缓冲区（见配方）
  1. 无菌磷酸盐缓冲盐（PBS）（康宁，目录号：21-040-cv）
  2. EDTA，0.5米（Quality Biological，Inc.，目录号：351-027-101）
  3. 胎牛血清（FBS）（亚特兰大生物制品，目录号：S11550）

设备

带血细胞仪玻片的光学显微镜
37°C培养箱，CO2对照，用于细胞培养工作（无细菌/病毒工作）
用于细胞培养工作（无细菌/病毒工作）的生物安全柜无菌培养罩
漩涡精灵
50毫升锥形管和流式细胞仪管用带插入件的冷冻旋斗离心机
流式细胞仪（例如，Becton Dickinson LSR II）
分析用计算机

软件

“未来作战系统快车”6.0流程（De Novo软件；美国加利福尼亚州格伦代尔）
GraphPad Prism 7（Graph Pad软件；加利福尼亚州拉乔拉市，美国）

程序

第一天

用2×10毫升无菌生理盐水腹腔灌洗，用10毫升注射器和18克针头从先前注射过巯基乙酸的动物体内收集巨噬细胞。我们通常收集2-5窝同性别的腹膜渗出液，以确保所有对照组和时间点都有足够的产量。一个典型的协议可以在这里找到：< HRFF＝“http://www. Jovi.com／VIED/1488／隔离-鼠标-腹膜腔细胞”目标＝“空白”＞http://www. jvv.com／视频/ 1488 /小鼠腹腔细胞的分离。
在93-218x g（热科学TX-750 4转子上1000转/分）下离心10分钟，然后在培养基中重新培养颗粒细胞。
使用血细胞仪（或细胞计数仪）计数细胞，并在1.5毫升培养基中向每个无菌的FACS管中添加1 x 106-1.5 x 106巯基乙酸诱导的腹腔巨噬细胞（TEPM）（见以下配方）。一个典型的实验包括三个时间点在非刺激和三个时间点在刺激巨噬细胞。对于每个时间点，您可以设置管如下：
1）未染色对照管，2）同型对照管，3）tlr4抗体染色未染色对照管，4）tlr4抗体染色lps刺激管，5）细胞与其他细胞标记物共染色时为单色对照，6）双色染色时为使用。轻轻地重述FACS管，以便在培养箱中进行气体交换。
让TEPM在37°C的培养箱中休息一整夜，培养箱中含有5%的一氧化碳2
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第2天

第二天早上，将100 ng/ml超纯大肠杆菌k235 lps添加到用于测量tlr4内化的每根试管中（非刺激对照组除外）。在刺激期间，轻轻地回顾FACS试管并返回37°C培养箱。
在适当的时间点，将每一管对照或lps刺激的tepms转移到冰浴中，并添加两体积的冰冷培养基或facs缓冲液（见下面的配方）以阻止tlr4内化。
在112-264x g（TX-750 4转子转速为1100转/分）下离心5-10分钟，在预冷的摆桶中放置颗粒电池。
注意：对于此清洗和所有后续清洗：倾析介质，通过在空管架上轻轻地运行流动管来重新消耗细胞，然后立即返回冰桶。如果要收集更多的时间点，请将这些细胞重新置于冰冷培养基中，并保持在冰上，直到最后一个样本从培养箱中取出。
用冰冷FACS缓冲液再清洗细胞两次。在最终体积为100μl的冰冷FACS缓冲液中再次使用。
加入2μgαfc cd16/32–（约4μl biolegend 101302）ab，在冰上孵育15分钟。这可防止fc介导的非特异性抗体结合。
加入0.5μg PE标记的抗TLR4抗体或同型对照品（可选：与其他抗体共染色以帮助识别细胞亚群）并在冰上孵育30分钟。
用冰冷FACS缓冲液清洗3个电池。
用冷冻PBS清洗1个。
要么立即进行流式细胞术，要么在100μl PBS中使用1%pfa（最终浓度）固定细胞。在0.5-1.0 ml PBS中重新培养细胞，并在流式细胞仪上运行之前，将样本通过70μm细胞过滤器进入干净的流管（无需无菌）以去除结块。

数据分析

流式细胞术分析
1. 对于流式细胞术分析，通过前向散射（fsc）曲线（峰高和峰面积）选择单个细胞。将每个样本的“停止门”设置为≥20000个单个事件。离开“记录门”记录所有事件。
2. 为了进行分析，fsc-a和ssc-a剖面上的门事件排除死细胞和细胞碎片。
3. TLR水平可在PE强度直方图中显示。
4. 数据（所有事件）将导出为fcs3.0文件。
TLR4内吞测定的数据分析。
1. 在fcs express 6.0中打开数据文件，微调“单细胞”和“活巨噬细胞”门。
2. 记录每个样品的中值荧光强度（mfi）。
3. 从每个样品的mfi中减去未染色细胞的mfi（自体荧光）。
4. 平均“0分钟时间点”TLR4染色样本的MFI（如果使用多个小鼠菌株，则对每个基因型进行此操作），并将MFI数据标准化为平均值（时间0分钟=100%）。
5. 内部化率计算为随着时间推移从表面损失的TLR4的百分比。
预期结果：在野生型小鼠中，未刺激细胞的tlr4表面表达水平在整个实验过程中应保持恒定，并远高于同型对照染色细胞的水平。lps刺激的细胞应以稳定的速率（至少在最初的90分钟内）失去表面表达。例如，请参见图1。
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图1。具有代表性的数据显示，在指定的时间点，tepms中tlr4对100 ng/mle colilps的内吞反应。tepms用抗小鼠tlr4抗体（克隆sa15-21）染色，并用流式细胞术分析。

笔记

我们强烈建议在开始这些实验之前测试不同数量的硫乙醇酸盐，因为内毒素污染是常见的，会预先激活巨噬细胞。
硫乙醇酸盐诱导的巨噬细胞的产量不仅取决于硫乙醇酸盐的数量，而且还取决于进行腹腔灌洗的实验室成员的经验水平，以及小鼠的年龄和菌株。下表（表1）显示了我们实验室6-8周龄常用菌株小鼠腹腔灌洗细胞产量的范围。
< > 表1。硫乙醇酸盐诱导巨噬细胞的典型产量。对于每个小鼠基因型，提供腹腔灌洗后获得的巨噬细胞的预期产量。对于c57bl/6j动物，新研究者获得的平均产量也显示出来。

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如果腹腔灌洗后的细胞颗粒看起来像血，我们使用ack缓冲液进行红细胞溶解，然后用无菌pbs进行两次洗涤，然后再在培养基中继续使用。
重要的是让巨噬细胞在分离后休息一整夜，以实现从一个实验到另一个实验的一致的内吞动力学。
添加脂多糖前检查每根管子。任何在夜间培养过程中酸化或变浑浊的试管都可能受到污染，应丢弃。
这个实验的成功依赖于保持细胞的低温以防止tlr4复合物的进一步内化。在低温下，细胞膜的物理性质从流体转变为凝胶（thewalt和bloom，1992；spink等，1996）。内化所需的蛋白质复合物仍将在膜内形成，一旦膜液化，内化将继续进行。因此，请务必对离心机进行预冷，并在将其从培养箱中取出时，提供一个冰桶和冰冷FACS缓冲液或用于快速冷却细胞的介质。尽量缩短离心机盖子打开的时间，避免接触流式细胞仪试管的底部，从离心机上取下试管时应立即将试管放回冰桶。在不接触底部的情况下，你可以在试管离心后用光托起试管进行目视检查：冷细胞的颗粒具有更高的不透明性。实验也可以在冷藏室进行。
该方法与其他细胞标志物的表面染色相一致。如果需要细胞内染色，我们建议设置一组平行的样品进行渗透性测试。

食谱

培养基
1. RPMI 1640+2%FBS+2 mm L-谷氨酰胺+1%PEN/STREP
2. 0.22μm过滤器灭菌
3. 在4°C下储存3周
facs缓冲区
1. 冰冷PBS+0.5%FBS+2 mm EDTA
2. 在4°C下储存3周

致谢

由美国国立卫生研究院（AI123371和AI125215 to S.N.V.）资助。这一协议是从以前的工作中得到修改或修改的（卡根等人），2015，2008，2011。

相互竞争的利益

我们声明这项工作没有任何利益冲突。

工具书类

Kagan，J.C.，Su，T.，Horg，T.，Chow，A.，Akira，S.和Medzhitov，R.（2008年）。tram将toll样受体4的内吞作用与干扰素-β的诱导作用结合起来。nat-immunol9（4）：361-368。

McIntire，F.C.，Sievert，H.W.，Barlow，G.H.，Finley，R.A.和Lee，A.Y.（1967年）。大肠杆菌中脂多糖的化学、物理和生物特性生物化学6（8）：2363-2372。

Perkins，D.J.，Richard，K.，Hansen，A.M.，Lai，W.，Nallar，S.，Koller，B.和Vogel，S.N.（2018年）。自分泌旁分泌前列腺素e2信号限制tlr4内化和trif信号。nat-immunol19（12）：1309-1318。

Rajaiah，R.，Perkins，D.J.，Ireland，D.D.和Vogel，S.N.（2015年）。tlr4内吞和trif信号的cd14依赖性显示配体特异性，在内毒素耐受中不可分离。原发性脊髓损伤a112（27）：8391-8396。

Spink，C.H.，Manley，S.和Breed，M.（1996年）。< HREF＝“Htp://www. NcB.NLM.NIH.GOV/PUMEDME/8603086]目标＝“空白”＞磷脂从凝胶到磷脂双层的液相传递热力学。 EM> Biochim Biophys Acta 1279（2）：190～196。

Takeda，K.和Akira，S.（2004年）。tlr信号通路。精原免疫16（1）：3-9；

Thewalt，J.L.和Bloom，M.（1992）。磷脂酰胆碱：胆固醇相图。Biophys J63（4）：1176-1181。

Zanoni，I.，Ostuni，R.，Marek，L.R.，Barresi，S.，Barbalat，R.，Barton，G.M.，Granucci，F.和Kagan，J.C.（2011年）。cd14控制lps诱导的toll样受体4的内吞作用。细胞147（4）：868-880。