材料和试剂

C57BL/6N小鼠线（Janvier实验室）：用于验证协议（7-8周前）
注：>
1. 如果在下面的方案中没有观察到学习或运动障碍，则可以使用其他小鼠系。下面我们将展示基于转基因线simcb1小鼠线（c57bl/6n背景）的图形示例。>
2. 必须考虑到鼠标的大小和强度，以便正确拧动轮子，避免自发旋转（太松）或动物无法转动（太紧）。>
安全a03（安全饮食，u8200g10r，开瓶后室温储存）含3.4kcal/g（61.3%来自碳水化合物，25.2%来自蛋白质，13.5%来自脂肪）：标准家庭食品
无尘精密微丸®< /SUP>，20毫克，啮齿动物纯化饮食，巧克力香精（BioSeV，产品αF05301，在室温下用硅胶储存后打开）含有3.60千卡/克（碳水化合物65.6%），20.6%来自蛋白质，13.9%来自脂肪）加上巧克力调味料：美味的食物奖励
噬菌体（法国克里斯汀噬菌体实验室）。用于非侵入性医疗器械和表面设计的抗菌消毒剂喷雾剂：用于清洗动物之间的操作室BR/>

设备

设备：操作调节室（法国佩萨克Jean Jaur_s大街156号，Imetronic，33600号，定制设备）（图1）
单独的操作调节室（28厘米长x 26厘米宽x 38厘米高）放置在一个木箱（60厘米长x 62厘米宽x 49厘米高）中，通风以确保空气流通和背景噪音。后侧有一个直径20厘米的车轮安装在中心，周围有两个鼻孔，上面有一个刹车片，可以锁定或解锁。左侧面板中央有一个食物托盘，托盘周围有两个鼻孔。根据任务的不同，可以使用灰色有机玻璃隐藏两个面板（后部或左侧）。地板上有一个格子，上面有一个装满垃圾的抽屉（垃圾和动物的笼子一样）。所有操作室都通过一个接口连接到计算机上，该接口允许（i）为每只动物/笼子分配文件和运动（见以下各节）和（ii）实时可视化动物行为和记录。对于给定的一批动物，活动的鼻孔被分配为右半部分动物的鼻孔，左半部分动物的鼻孔，以平衡位置。
< BR>
图1。用于车轮转动和美味食物的操作室。a.车轮转动的配置包括安装在后部的车轮，车轮周围有两个与灯光提示（黄色圆圈）相关的探鼻孔，可以与顶部的另一个灯光提示（红色圆圈）配对。轮子（左面板被灰色有机玻璃覆盖）。地板是由一个垃圾抽屉顶部的金属网构成的。b.美味食物的配置包括在左侧面板上的食物托盘，由两个与灯光提示（黄色圆圈）相关联的鼻孔包围，可以与食物托盘顶部的另一个灯光提示（红色圆圈）配对（背面由灰色有机玻璃覆盖）。地板是由一个垃圾抽屉顶部的金属网制成的。c.选择配置包括移除两个灰色有机玻璃面，以自由获取两个奖励。地板是由一个垃圾抽屉顶部的金属网制成的。摘自Hurel等人的插图。>（2019年）。

软件

Polywheel 5.2.2（2015年4月16日）法国Jean Jaur_s 33600 Pessac大街156号，IMETronic：允许分配运动的在线软件（见“程序”一节和“运动设计”一节），以及从操作室实时获取数据
poly files v4.5.2（2018年4月9日）法国Jean Jaur_s 33600 Pessac大街156号，IMETronic：使用离线软件将使用预定义变量的数据提取到Excel文件中
GraphPad Prism版本8（GraphPad软件2365 Northside Dr.，Suite 560，San Diego，CA 92108）：数据分析

程序

注：所有实验均在亮/暗周期的暗阶段进行，以处于激活阶段。因此，我们的工作周期是12小时/12小时，上午10点熄灯，晚上10点亮。>

驯化
1. 在实验开始前一周让动物习惯于倒周期。
2. 使动物个体化。
3. 在开始治疗方案前三天，在家庭笼子里放入3-4粒巧克力食物，以避免患上新厌症。
  < BR>
操作性条件反射会话的一般描述
1. 为每个鼠标选择特定的文件（每个钢筋计划和每个鼠标一个例如，fr1_mouse1）。
2. 选择相应的练习（参见程序：练习设计）。
3. 把老鼠放在手术室里。
4. 开始录音。
5. 在会话结束时，将鼠标从操作室中取出。
  < BR>
如果是为了美味的食物：
1. 在1）食物盘和2）网格下的垃圾中计算剩余的颗粒。
  < BR>
对于车轮转动和美味的食物：
1. 使用噬菌体清洁操作室®，如果在可口的食物会议中，用干燥空气喷雾清洁食品托盘。
  < BR>
对于习惯化，fr1和fr3会话：
1. 回到步骤b1进行一天中的第二次训练（第二次奖励）。
注意：为了避免同一天一个奖励对另一个奖励的影响，一半的动物必须从一个轮滑开始，另一半必须从一个美味的食物开始，顺序每天颠倒。>
< BR>
习惯化（2天）
1. 运动设计
  车轮转动
  1. 每次训练持续30分钟。
  2. 与轮子配对的提示灯（在轮子上方）在会话开始时打开，并保持打开30分钟。
    注意：车轮配对提示灯指示车轮的可用性。因此，它在整个习惯化会话中都保持打开状态。>
  3. 在整个会话过程中，控制盘始终保持解锁。
    < BR>
  美味的食物
  1. 每次训练持续30分钟。
  2. 与食物盘配对的提示灯（顶部）在会话开始时打开，并保持30分钟。
    注意：食物托盘配对提示灯指示食物托盘中食物颗粒的运送。因此，它在整个习惯化会话中都保持打开状态。>
  3. 在会议开始时连续分发了17个小球。
2. 实际步骤
  1. 用合适的金属件盖住所有鼻孔。
  2. 放置适当的有机玻璃墙以覆盖食物托盘或轮子及其相应的鼻孔。
  3. 按照程序B的指示，对两项奖励进行两次培训（1次/天）。
  4. 不需要满足任何条件就可以进入下一步。
  < BR>
固定比率1钢筋表（5天）
1. 运动设计
  车轮运行（图2）>
  1. 会议持续30分钟。
  2. 训练开始时没有任何灯光提示，车轮被刹车片挡住。
  3. 活动端口中的一个nose poke（np）触发一个奖励序列，同时：
    1. 五秒NP配对提示灯亮。
      注意：这个np成对的提示灯是一个条件刺激，表示进入轮子所需的努力已经完成。> < BR>
    2. 第二十二个车轮配对提示灯亮起。
      注意：t>车轮配对提示灯是指示车轮可用性的条件刺激。>
    3. 第二十二次解锁车轮（拆卸制动片）。
  4. 奖励序列中的鼻子戳被记录，但没有功能性后果。
  5. 在奖励序列之后，程序返回到第一步，直到下一个np。
  < BR>
  图2。固定比率1车轮运行加固计划的逻辑图。在30分钟的会话中，在返回初始状态之前，在活动端口中插入一个鼻子可以访问20秒的奖励序列。np：鼻子戳。
  < BR> 可口的食物（图3）>
  1. 会议持续30分钟。
  2. 会议开始时没有任何灯光提示，食物盘是可用的，但空的。
  3. 活动端口中的一个np触发一个奖励序列，同时：
    1. 五秒NP配对提示灯亮。
      注：NP配对提示灯是一种条件刺激，表示获得一个食物颗粒所需的努力已完成。>
    2. 15秒食物托盘配对提示灯亮。
      注意：食物托盘成对提示灯是一种条件刺激，指示一个食物颗粒的运送。>
    3. 分发一个巧克力食物颗粒。
  4. 奖励序列中的鼻子戳被记录，但没有功能性后果。
  5. 在奖励序列之后，程序返回到第一步，直到下一个np。
  < BR>
  图3。固定比率1强化美味食物计划的逻辑图。在30分钟的训练中，在回到初始状态前，在活动端口中插入一个鼻子，可获得15秒的奖励序列。np：鼻子戳。
  < BR>
2. 实际步骤
  注：为了便于学习，在前2-3节课中，对动物进行温和的食物限制，以达到体重稳定下降10%的效果。>
  1. 从鼻孔取出所有金属件，使其易于接近。
  2. 放置适当的有机玻璃墙以覆盖食物托盘或轮子及其相应的鼻孔。
  3. 按照程序B的指示，对两项奖励进行五次（1次/天）的培训。
  4. 不需要满足任何条件就可以进入下一步。
    < div > < BR>
固定比率3钢筋表（5天）
1. 运动设计
  车轮运行（图4）>
  1. 会议持续30分钟。
  2. 训练开始时没有任何灯光提示，车轮被刹车片挡住。
  3. 活动端口中的三个连续np触发一个奖励序列，同时：
  < BR>
固定比率1钢筋表（5天）
1. 运动设计
  车轮运行（图2）>
  1. 会议持续30分钟。
  2. 训练开始时没有任何灯光提示，车轮被刹车片挡住。
  3. 活动端口中的一个nose poke（np）触发一个奖励序列，同时：
    1. 五秒NP配对提示灯亮。
      注意：这个np成对的提示灯是一个条件刺激，表示进入轮子所需的努力已经完成。> < BR>
    2. 第二十二个车轮配对提示灯亮起。
      注意：t>车轮配对提示灯是指示车轮可用性的条件刺激。>
    3. 第二十二次解锁车轮（拆卸制动片）。
  4. 奖励序列中的鼻子戳被记录，但没有功能性后果。
  5. 在奖励序列之后，程序返回到第一步，直到下一个np。
  < BR>
  图2。固定比率1车轮运行加固计划的逻辑图。在30分钟的会话中，在返回初始状态之前，在活动端口中插入一个鼻子可以访问20秒的奖励序列。np：鼻子戳。
  < BR> 可口的食物（图3）>
  1. 会议持续30分钟。
  2. 会议开始时没有任何灯光提示，食物盘是可用的，但空的。
  3. 活动端口中的一个np触发一个奖励序列，同时：
    1. 五秒NP配对提示灯亮。
      注：NP配对提示灯是一种条件刺激，表示获得一个食物颗粒所需的努力已完成。>
    2. 15秒食物托盘配对提示灯亮。
      注意：食物托盘成对提示灯是一种条件刺激，指示一个食物颗粒的运送。>
    3. 分发一个巧克力食物颗粒。
  4. 奖励序列中的鼻子戳被记录，但没有功能性后果。
  5. 在奖励序列之后，程序返回到第一步，直到下一个np。
  < BR>
  图3。固定比率1强化美味食物计划的逻辑图。在30分钟的训练中，在回到初始状态前，在活动端口中插入一个鼻子，可获得15秒的奖励序列。np：鼻子戳。
  < BR>
2. 实际步骤
  注：为了便于学习，在前2-3节课中，对动物进行温和的食物限制，以达到体重稳定下降10%的效果。>
  1. 从鼻孔取出所有金属件，使其易于接近。
  2. 放置适当的有机玻璃墙以覆盖食物托盘或轮子及其相应的鼻孔。
  3. 按照程序B的指示，对两项奖励进行五次（1次/天）的培训。
  4. 不需要满足任何条件就可以进入下一步。
    < div > < BR>
固定比率3钢筋表（5天）
1. 运动设计
  车轮运行（图4）>
  1. 会议持续30分钟。
  2. 训练开始时没有任何灯光提示，车轮被刹车片挡住。
  3. 活动端口中的三个连续np触发一个奖励序列，同时：
    会议开始时没有任何灯光提示，食物盘是可用的，但空的。
  4. 执行n×3 NP（以n为奖励访问的Em＞，轮的第一次访问需要1×3＝3 NP，第二个2×3＝6 NP NP等< 在活动端口中触发序列：3, 6, 9，12, 15, 18，21, 24, 27…）同时触发一个奖励序列：
    1. 五秒NP配对提示灯亮起。
    2. 15秒食物托盘配对提示灯亮。
    3. 一个巧克力食品颗粒分布。
  5. 奖励序列中的鼻子戳被记录，但没有功能性后果。
  6. 在奖励序列之后，程序返回到第一步，直到下一个np。
  < BR> < IMG类＝“DoOtStWh”宽度＝“300”高度＝“136”ALT=“”SRC=“/附着/图像/ 20190928 /2019928034035Y1774.JPG”/>
  图7。可食性食品强化的进度比表的LogigRAM。<强>在30分钟的会议期间，获得每一个奖励序列所需的获得颗粒的努力逐渐增加。动物完成的最后一个比率是断点。np：鼻子戳；n：获得奖励的等级号。
  < BR>
2. 实际步骤
  注：此测试旨在评估动物愿意花费的最大努力以获得奖励。因此，考虑到任务的高要求性质，对每只动物每天进行一次独特的30分钟训练。>
  1. 从鼻孔取出所有金属件，使其易于接近。
  2. 放置适当的有机玻璃墙以覆盖食物托盘或轮子及其相应的鼻孔。
  3. 第一天，一半的动物将经历一轮独特的公关轮子运行，另一个独特的一系列PR的适口食品。为此，将步骤B的指令应用于步骤B1至步骤B7。
  4. 第二天，动物进行一次独特的公关会议，奖励不是在第一天。为此，将程序B的指令从步骤B1应用到步骤B7。
  5. 不需要满足任何条件就可以进入下一步。
    < BR>
固定比3钢筋后进度比表（1天）
注意：此步骤旨在确保动物的性能恢复到PR之前的水平。>
1. 运动设计
  遵循程序E1的指示
2. 实际步骤
  按照程序E2指示1天
  < BR>
选择（图8）（视频1）
1. 练习设计
  1. 疗程持续60分钟。
  2. 会议开始时没有任何灯光提示，车轮被刹车片挡住，食物盘空空如也。
  3. 如果动物在车轮运行的活动端口中执行3个连续np，它将访问车轮奖励序列：
    1. 同时：
      五秒np配对提示开启
      第二十二轮配对提示开启
      第二十二个车轮解锁
    2. 奖励序列中的鼻子戳被记录，但没有功能性后果。
    3. 在奖励序列结束时，一个绿色的天花板灯打开5秒，在此期间没有奖励是可访问的。鼻刺是有记录的，但没有功能性后果。
    4. 然后，程序返回到步骤h1b的开始，直到下一个np。
  4. 如果动物在活动端口为美味的食物连续执行3次np，它将获得美味食物奖励序列：
    1. 同时：
      五秒np配对提示开启
      15秒食物托盘配对提示打开
      分发一个巧克力食物颗粒
    2. 奖励序列中的鼻子戳被记录，但没有功能性后果。
    3. 奖励序列结束时，绿色天花板指示灯将亮起5秒，在此期间无法获得奖励。鼻刺是有记录的，但没有功能性后果。
    4. 然后，程序返回到步骤h1b的开始，直到下一个np。
  < BR>
  图8。在轮子转动和美味食物之间进行选择的逻辑图。戳鼻可以获得一项奖励，但选择是相互排斥的，这意味着选择一项奖励不包括在给定时间内获得另一项奖励的可能性。
  < BR>
  视频1。选择会话显示（i）食物奖励序列，然后是（ii）轮子奖励序列 < BR>
2. 实际步骤
  1. 喂养动物的选择（5天）
    1. 从鼻孔取出所有金属件，使其易于接近。
    2. 移除所有有机玻璃墙，使两个奖励都可获得。
    3. 按照步骤b1至步骤b7中步骤b的说明执行五个会话。
  2. 轻度饮食限制下的选择
    1. 在第一节课前黑暗阶段的前一个小时，把食物从家里的笼子里拿出来。
    2. 在黑暗阶段的前一个小时，称一下动物的体重。
    3. 从鼻孔取出所有金属件，使其易于接近。
    4. 移除所有有机玻璃墙，使两个奖励都可获得。
    5. 执行一个会话，应用步骤b1到步骤b7中步骤b的说明。
    6. 计算食物量：
      
      1）
      
      平均每日消费的百分之七十。
      
      2）
      
      减去疗程中的进食量。
    7. 在操作性条件反射结束后至少1小时，将食物放入家庭笼中
    8. 在接下来的几天执行其他会话，应用步骤h2b ii到h2b vii。
  注意：体重必须在正常体重的85%到90%之间。如果高于或低于此范围，则相应减少或增加食物量。>

数据分析

纳入标准
1. 通过
2. 在FR3步骤结束时，动物应在连续3个疗程内表现出稳定的表现：<；活动鼻戳次数的20%变化。
3. 不符合上述标准的动物将被从实验中丢弃。
  < BR>
所有协议
1. 活动鼻戳次数：（图9）
  采用双向方差分析（重复测量）分别对方案的每个步骤（fr1、fr3和choice）进行分析。
2. 不活动的鼻子戳的数量（图9）。
3. 每个奖励序列的运行持续时间
  1. 该指数提供了动物每次进入轮子时的跑步次数（详情见Muguruza等人，2019年）。
  3. 用双向方差分析（重复测量）分别对方案的每个步骤（fr1、fr3和choice）进行分析。
4. 消耗的颗粒
  1. 该指数衡量所获得奖励的消耗量（以确保消耗所获得的颗粒）。
  2. 用双向方差分析（重复测量）分别对方案的每个步骤（fr1、fr3和choice）进行分析。
    < BR>
累进比（图9）
1. 活动鼻戳次数：（图9）用双尾学生t检验分析。
2. 断点：（图9）用双尾学生的t检验进行分析。断点被定义为PR会话期间到达的最后一个奖励步骤，换句话说，它对应于动物在给定会话中为获得一个奖励而接受的最大鼻子戳次数。
3. 消耗的颗粒：通过双尾学生t检验进行分析。
4. 如果结果不符合正态性，则应使用mann-whitney检验对c.1、c.2和c.3进行分析。
  < BR>
  图9。表示每个奖励单独呈现（fr1、fr3和pr）时的戳鼻次数和断点数。这里呈现的图表是从SIM-CB1小鼠系中获得的数据，将敲除小鼠（sim-cb1-ko）与其野生型幼鼠（sim-cb1-wt）进行比较。这种转基因小鼠系在sim1阳性细胞中含有大麻素1型受体（cb1r）的缺失，主要见于下丘脑室旁核（pvn）。对于车轮转动（上面板）和可口的食物（下面板），表示在固定和渐进比率强化计划（左）上执行的鼻孔戳数和渐进比率会话（右）期间达到的断点。np：鼻子戳。
  < BR>
选择会话
1. 活动鼻刺的数量（图10）：分别对每一步进行双向方差分析（重复测量）。随意喂养和食物限制。 < BR>
  图10。表示SIM-CB1小鼠线（wt vs.ko）选择过程中活动鼻戳的数量。这里提供的图表是从SIM-CB1小鼠线获得的数据，将敲除小鼠（sim-cb1-ko）与其野生型产仔鼠（simcb1 wt）进行比较。这种转基因小鼠系在sim1阳性细胞中含有大麻素1型受体（cb1r）的缺失，主要见于下丘脑室旁核（pvn）。空白区和灰色区分别是 >自由> FED和食物限制条件下的选择会话。< BR> < BR>
2. 偏好比率（图11）：允许评估一个奖励的表现（例如，喜欢在美味的食物上碾轮子），指标允许个体间的比较。
  < BR>
  < BR> 采用双向方差分析（重复测量）分别对每一步进行分析（随意喂养和限制饮食）。
  < BR>
  图11。sim-cb1小鼠系（wt与ko）的偏好比表示法。这里提供的图表是从sim-cb1小鼠系获得的数据，比较了敲除小鼠（sim-cb1-ko）和野生型产仔鼠（sim-cb1-wt）。这种转基因小鼠系在sim1阳性细胞中含有大麻素1型受体（cb1r）的缺失，主要见于下丘脑室旁核（pvn）。分数超过50%表示喜欢开车，分数低于50%表示喜欢美味的食物。白色部分：随意>美联储条件选择会议；灰色部分：食品限制条件。< BR>

致谢

感谢Marsicano团队所有成员的批评和有益的讨论。我们要特别感谢谢尔盖·艾哈迈德博士（IMN，CNRS UMR 5293，波尔多）分享了他在该领域的经验以及他在制定协议方面的帮助。我们感谢imetronic公司（法国pessac）的提供和他们对项目设计的帮助。最后，我们承认动物设施和基因分型平台的成员在NeuroCentre Magendie（SIMUM U1215，波尔多，法国）的帮助。 < BR> 这项工作得到了国家医学院（通用汽车公司）、阿基坦研究所（通用汽车公司）、波尔多大学（通用汽车公司）、法国路德控制药物研究所（通用汽车公司）、波尔多阿基坦实验室神经科学研究所（通用汽车公司）和联合国科学院的支持。德拉雷切赫和德勒的创新（到BR）。

竞争利益

作者没有利益冲突。

伦理学

所有实验均服从法国（法国）和欧洲（2010/63 / EU）动物实验规则，授权号为马利和动物设施。

工具书类

Belke，T.W.（1997年）。跑步和响应被跑步机会强化：强化持续时间的影响。j exp anal behav>67（3）：337-351。
Cantin，L.，Lenoir，M.，Augier，E.，Vanhille，N.，Dubreucq，S.，Serre，F.，Vouillac，C.和Ahmed，S.H.（2010年）。< HREF=“HTTP//NCBI.NLM.NIH.GOV/PUBMED/2067 6364”目标＝“空白”>可卡因在大鼠价值阶梯上的低值：可能是对成瘾的恢复力的证据。 EM > PLOS1＞5（7）：E11592。
科雷亚，M，Pardo，M，巴亚利，P，Lopez Cruz，L，圣米格尔，N.，ValvdE，O.，Ledent，C和Salamone，J. D.（2016）。< HREF＝“HTPF//NC.NLM NIH.GOV/PUBMED/2655 4367”目标＝“空白”>选择蔗糖消耗的自发性运动取决于多巴胺传递：氟哌啶醇在野生型和腺苷A（2）AKO小鼠中的作用。 EM>精神药理学（BEL）＞233（3）：33-404。
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