材料和试剂

分光光度分析用塑料比色杯（即>，Sigma-Aldrich，目录号：C5677）
寄生虫培养用塑料瓶25和50 cm2
塑料吸管头（适用于20μl、200μl和1 ml吸管）
无菌塑料移液管（1毫升、2毫升、5毫升和10毫升，任何公司提供）
Falcon塑料管15和50毫升（来自任何公司）
塑料Eppendorf试管1.5毫升（任何公司提供）
Gilson或Eppendorf移液管（或任何其他公司的移液管），容量分别为1μl、20μl、200μl和1 ml
E.> TrutoLoa>前鞭毛体（LosiSH P10，耶拿生物科学，目录号：LT-101）
Plexsy-Sat2载体（Jena Biosciences，目录号：EGE-274）
脑心灌注（LISSY肉汤BHI，耶拿生物科学，目录号：ML412S），储存于4℃时稀释在无菌DH＜2 < /Su>
Hemin（Jena Biosciences，目录号：ML-108L），储存于RT
L-生物喋呤（开曼群岛，目录号：10007662），储存于-20°C
牛血清蓖麻素（Lexsy NTC，Jena Bioscience，目录号：AB-102L）。用无菌dh2o制备10mg/ml溶液，在-20℃下分100μl保存，在4℃解冻后保存。
RPMI 1640谷氨酰胺（Thermo Fisher，目录号：61870-010），储存于4°C下
施耐德（Sigma-Aldrich，目录号：S-9895），储存于4°C
HIFBS：FBS（从GiBCO、TeaMiFisher、BioSeaR或其他任何公司测试），储存在-C°C，在56℃下灭活30分钟，然后加入培养基中。
青霉素链霉素10000 U/ml（100倍浓缩，热科学，目录号：15140-122或来自任何其他公司测试），储存于-20°C
HEPES 1 M（Thermo Fisher Scientific，目录号：15630080），储存于4°C
4-硝基苯基磷酸酯二钠盐六水合物，p>npp（sigma aldrich，目录号：p4744），粉末储存在-20°C下。为每个实验准备10 mm新鲜溶液
pH 4.8（25°C）的90 mm柠檬酸盐缓冲液（Sigma-Aldrich，目录号：C2488），储存于2-8°C
NaOH 0.5 M溶液（APPLICHEM，目录号：181692.1211），储存于室温下
酒石酸钠（5 mm）溶液；L（+）-酒石酸（默克，目录号：100804，或西格玛·奥尔德里奇，目录号：T109），储存在室温下
0.4%（w/v）台盼蓝溶液（Gibco，目录号：15250061；或Sigma-Aldrich，目录号：T8154）
福尔马林100%（37% W/V甲醛溶液；MEC：目录号F875或任何其他CONMANE）< BR/>

设备

血细胞仪（Malassez，Marienfeld，目录号：0640610）
在25°C下运行的用于培养寄生虫培养物的孵化器（例如，Sel-Lab微生物或CuSub＞2＜/Sub孵育器，< HREF＝“http://www-SeldOnguto.Com/Sel-Lab孵器”目标＝“空白”> http://www. SeldoNeald.com /sEL实验室孵化器或来自任何其他公司）
水浴（即，ed13，julabo）
分析天平（＞＞50，梅特勒）；
Spectrophotometer（即>，StaseSpple Plus分光光度计，170—2525，BIO RAD）
台式离心机（即，Juang-CR3i多功能，热）
Microcentrifuge（即>，埃彭多夫54 17R）< BR>

软件

GraphPad Prism软件5.01（GraphPad，加利福尼亚州圣地亚哥）

程序

利什曼原虫原鞭毛体无菌培养
1. Em＞L. donovani＞EM＞＞Em＞EM＞EM＞EM＞L.
2. 当从一个冰冻的小瓶开始时，用25℃的水将烧杯浸入烧杯中，然后用1毫升的无菌培养液在9毫升培养基中用100毫升的培养液（1640，40）（10%）和抗生素（青霉素稀释1倍稀释）（50毫升），在室温下1000x g下再悬浮和离心7分钟。
3. 取出序列号，在10毫升培养基中重新培养，并转移到25厘米的2烧瓶中，盖上盖子（不带过滤器）。
4. 在25°C的培养中，没有Co＜2＞/Sub＞（PAPADAKI等2015）。
5. 寄生虫继代培养于10 6 寄生虫/ml，在6 -7（SUP> TH＜SUP/SUP>培养基中，寄生虫密度为~2×10）SUP> 7 2.5×10 10，SUP> 7 寄生虫/ml。
6. 寄生虫采集通过离心（1000x g，rt下7分钟）进行。
7. 寄生虫可以培养多达10个通道，然后一个新的文化应从一个小瓶与冷冻细胞。
8. 培养液＞E.> TalutoLe > 25℃脑灌流（Listy Burth-BHI）培养基，终浓度为0.25%（W/V）、10μm L生物蝶呤和青霉素链霉素（1X），添加hemin（5μg/ml）。
9. 基因修饰的寄生虫在与亲本菌株相似的条件下培养，但在使用基于Plexsy-Sat2载体的质粒进行基因修饰时添加牛血清蓖麻素（100μg/ml）。
10. 对于寄生虫的维持，Em> L. donovani 菌株（10×SUP> 7细胞），每周除去一次，除去9毫升的旧培养物，再加入9毫升新鲜培养基（1/10稀释液）。
11. 对于细胞计数
  1. 用血球计（Malasez）计数小细胞培养物（100μL），并将其转移到含有900μl 2%（W/V）福尔马林的EpBordRF管中，在RT.。
  2. 等待2-3分钟。
  3. 取100μl，置于血细胞仪的一个室中。
    注意：使用血细胞仪时，您可以观看像>https://www.youtube.com/watch？V=WWS9SZBGJ6A>。> < BR>
  4. 用40倍放大镜在显微镜下观察。
  5. 为了计算Malasez血球计中的细胞，请参阅图像（图1），下面是Malasez腔的表示。< BR>
  < BR> < IMG类＝“DoOtStWh”宽度＝“300”高度＝“190”ALT=“”SRC=“/附着/图像/ 20190928 /20199280845 52Y7172.JPG”/>
  图1。Malasez血球计室的图形表示。< /强>计数在几个或所有大方格中的细胞（每个方块的面积为0.05毫米 2和0.2毫米深度代表0.01毫米的体积 3 ＝10 5 ml）。将计数的细胞数除以观察到的平方数，再乘以105/ml。然后乘以稀释因子（在本例中为10）。如果寄生虫培养密度较低，则在计数前用较小体积的福尔马林稀释。< BR> < BR>
利什曼原虫前鞭毛体酸性外磷酸酶测定方法的研究用磷酸酶底物对硝基苯基磷酸酯（p>npp）（10 mm）在pH 4.8（Sigma-Aldrich）的90 mm柠檬酸缓冲液中，在25°C或37°C下测定活利什曼原虫>前鞭毛体表面的酸性外磷酸酶活性30分钟，并加入或不加入酒石酸钠（5 mm，L（+）-酒石酸；默克）。酯化键的水解和p>npp的去磷酸化产生对硝基苯酚化合物，在通过添加0.5_naoh终止反应后，通过测量其在405nm处的吸光度来量化该化合物（图2）。
< BR> < IMG类＝“DoOtStWh”宽度＝“300”高度＝“165”ALT=“”SRC=“/附着/图像/ 20190928 /20199280846153322.JPG”/>
图2。Em＞P> NPP底物的去磷酸化反应的示意图。< <强>＞Leishmania < 前鞭毛体的酸性磷酸酶反应可在生长的对数生长期（培养后48～72小时）或生长静止期（6 Th）进行。接种后第7天）。 < BR>
1. 用离心法（1000x g，7分钟，rt）采集利什曼原虫前鞭毛体（1-2x 107）。
2. 用5毫升100毫米HEPES溶液重新悬浮细胞颗粒，并用相同的缓冲液洗涤两次。
3. 计数细胞（如步骤11，A），通过显微镜下观察寄生虫活力（在显微镜载片上分配50μl细胞悬液并用4X透镜观察）评估细胞活力，并用0.4%（W/V）台盼蓝染色（即>）进行定量。如在台盼蓝染色议定书。计数和细胞存活率可以同时进行。
4. 离心大体积细胞悬液（1000x g，7分钟）。
5. 丢弃上清液（序列号）。
6. 在90 mL柠檬酸盐缓冲液中，在pH为4.8的柠檬酸盐缓冲液中，在500μL反应溶液中回收细胞颗粒，在90℃柠檬酸盐缓冲液（pH 4.8）下，加入或不加入酒石酸钠5 mL L（+）-酒石酸，在适当的反应温度（25℃或37℃）下进行预处理。
7. 将细胞在25°C或37°C的反应混合物中培养30分钟。
8. 通过加入0.5 N NaOH（1毫升/样品）终止反应。
9. 离心（2000x g>，5分钟）除去寄生虫。
10. 将序列号转移到塑料试管中进行分光光度分析。
11. 在405nm处测量反应产物的吸光度（p>-硝基苯酚=p>np）。
12. 计算酶活性（A<＜405＜/SUB>值），对每个独立实验（A＜405＜405分/次＞7＞7 /SUP>细胞/ml）的平均细胞数/ml进行归一化处理。
13. 在反应条件下评价细胞裂解引起的酸性磷酸酶活性：
  1. 孵育反应缓冲液，与每个细胞类型的磷酸酯酶体积相等，与每个反应所用的Leishmania 前鞭毛体相同数目，在底物30分钟、25℃或37℃的情况下，取决于你们进行反应的温度。
  2. 离心细胞（2000x g，5min）后恢复s/n。
  3. 增加10 mmpnpp。
  4. 孵育30分钟。
  5. 如上所述测量酸性磷酸酶活性。
14. 如步骤b2所述接入小区生存能力。

数据分析

酸性磷酸酶活性可以用图表形式（图3）或表格（表1）表示。使用GrAPPAD棱镜软件5.01（GrAPPad，圣地亚哥，CA）准备和分析图表和统计意义。配对学生的 t>检验，评价各组间的统计学意义。AP＞值＞0.05，差异有统计学意义。
< BR> < IMG类＝“DoOtStWh”宽度＝“300”高度＝“164”ALT=“”SRC=“/附着/图像/ 20190928 /201992808464 71.1453. JPG”/>
图3。四种不同Leishmania sp活鞭毛体酸性磷酸酶测定结果的图解（ L. donovani 菌株LG13， L.在5米塔酸钠（+酒石酸盐）或不存在抑制剂的情况下，估计了磷酸酶活性。值被归一化到活细胞的百分比。a.在没有酒石酸钠的情况下进行分析。b.向分析混合物中添加5 mm酒石酸钠。< L.Eng/EM> FreLDLIN菌株的活性显著高于L.GH1和L. donovani > LG13菌株，活性为Gt；90%酒石酸钠抗性。误差线是3个独立实验的标准差分。采用双尾配对的 t>检验，与对照值（L. donovani > -LG13）相比，*> <>＞0.01和≤0.001。ns：不显著。
< BR> 表1。生长期静止期利什曼原虫前鞭毛体的酸性磷酸酶活性< < /强>结果为3个独立实验，±STD值＊，* P>≤0.05和0.01，与对照值（ L. donovani >菌株LG13）比较，差异有统计学意义，双尾配对学生t检验。（Papadaki Amalia，博士论文2015，< HeRF= =“http://www-diktutkk.Gr/EdAd/Heale/1042/3638”目标=“yBLASH”＞http://www-diktutik.Gr/EADAD/句柄/ 10442/39638＜/a>。值被归一化到活细胞的百分比。 < IMG类＝“DoOtStWh”IG=“”宽度＝“650”高度＝“212”ALT=“”SRC=“/附着/图像/ 20190928 /20199280848 185516.PNG”/>

笔记

细胞的活力应在培养基孵育前和孵育后定性评估，通过显微镜下观察寄生虫的活动性，并用0.4%（W/V）台盼蓝染色或用另一种重要染料染色，如协议中所述。
此外，应该确认，在活细胞分析中测定的酶活性是由于酸性E-磷酸酶（S）而不是由A释放的酶）在反应中培养相同数量的寄生虫，在37°C下用30分钟进行反应，b）离心去除寄生虫，C）在没有细胞的培养基中进行PNPP水解试验（Cedro Fernandes 等.，2003）。

致谢

这项工作是由希腊巴斯德研究所资助的（A HRFF＝“http://www. PaSTur.G/[目标] =“http://www.巴斯德.Gr ”AP和HB，来源于GoEngEngA A的赞助（< HRFF＝http://www. Geesistura.Gr/HOMENG.HTM）目标=“http:http://www. GunesiasPaa.Gr/HangEn.HTM ）Hb，和一个双边研究和。技术合作希腊-法国2013赠款（第1811号）由希腊总研究和技术秘书处资助（“HREF＝”HTTP//www. gSr.Gr/Calimal.ASPX？sid=119i428i1089i323i488743“target=”\u blank“>http://www.gsrt.gr/central.aspx？SID=119I428I1089I323I488743）AP和HB。