材料和试剂

500毫升过滤装置，带0.22μm过滤器（费希尔，目录号：974102）
24孔组织培养板（Thermo Fisher，目录号：142475）
T75组织培养瓶（Thermo Fisher，目录号：156499）
2毫升移液管（Fisher，目录号：13-678-25C）
10cm盘子（Thermo Fisher，目录号：150464）
15毫升Falcon试管（康宁，目录号：35296）
1毫升移液管（Fisher，目录号：13-678-25B）
镊子（Fisher Scientific，目录号：XX6200006P）
刀片（Fisher Scientific，目录号：12-640）
玻片（VWR，目录号：89500-466）
模拟人生单元（根据要求提供）
不含丙酮酸钠的无菌DMEM培养基+高糖培养基
无菌1X PBS CA+2-mg+2免费（赛默飞世尔，目录号：110010031）或1X HBSS CA+2-mg+2免费（赛默飞世尔，目录号：14175079）
青霉素链霉素（Thermo Fisher，目录号：15140122）
无菌美国农业部批准的FBS（Sigma-Aldrich，目录号：F2442-500ml）
0.25%胰蛋白酶EDTA（Sigma-Aldrich，目录号：T4049-100ml）
表皮生长因子（egf）（sigma-aldrich）
谷氨酰胺（Gibco/Thermofisher，目录号：35050061）
成纤维细胞生长因子-2（FGF2）（研发，目录号：3139FB025）
N2（赛默飞世尔，目录号：17502048）
地塞米松（vwr，目录号：80056-298）
三碘甲状腺原氨酸（Sigma-Aldrich，目录号：709719）
维甲酸（Thermo Fisher，产品目录号：AA4454077）
Hydrocortisone（西格玛奥德里奇，目录号：H088）
霍乱毒素（Sigma奥德里奇，目录号：C8052）
钙，99%，颗粒状（Fisher，目录号：AC201180050）
生长因子还原基质凝胶（bd biosciences，目录号：354230）
Ⅰ型胶原，Rat Tail（MiLople，目录号：2790888）
4%全氟辛烷磺酸（VWRAAJ61899-AK）
台盼蓝0.4%（赛默飞世尔，目录号：15250061）
O.C.T.化合物（Fisher Scientific，目录号：23-730-571）
模拟人生亚文化培养基（见配方）
差异化媒体（参见配方）

设备

水浴（Thermo Scientific，目录号：TSGP02）
真空泵抽吸器（标准）
培养箱（标准）
冰冻切片机（标准）
Brightfield显微镜（标准）
共焦激光扫描显微镜（标准）

软件

ImageJ软件（http://imagej.net/“target=”\u blank“>http://imagej.net，可在线下载）

程序

模拟人生亚文化
1. 预温细胞培养基，1倍PBS Ca+2-mg+2游离或1倍HBSS-Ca+2-mg+2游离，37°C水浴中0.25%胰蛋白酶EDTA。
2. 用真空吸管吸出旧培养基或用10毫升吸管从T75细胞培养瓶中手动吸出。
3. 用10毫升无菌1X PBS/HBSS Ca+2-mg+清洗两次，用2毫升移液管或用吸液器和无菌新鲜2毫升玻璃移液管手动完全吸出。
4. 每T75烧瓶加入3毫升预热的0.25%胰蛋白酶EDTA。
5. 将培养板与细胞在37°C下培养5-7分钟。轻敲并轻轻摇动培养板以取出细胞。
6. 通过添加新鲜的3-5毫升培养基，用10毫升移液管中和胰蛋白酶。移液管轻轻上下数次，重新悬浮细胞，并转移到15毫升猎鹰管。
7. 离心机在100X g＞3 min，用1X PBS Ca＞2＋/SUP> - Mg 2自由洗涤2次，取所需培养基中的细胞。
8. 在T75组织培养瓶中培养100万个细胞，在4-5天内达到95%的融合率。
  注：细胞活力（~90-95%）由台盼蓝细胞计数决定。>
  
  < BR>
器官分化培养
1. 在sims培养基中以0.4x 106细胞/ml的速度重新培养sims细胞。
2. 解冻生长因子，在培养前10分钟，在冰上还原基质胶基质。胶原蛋白和MatMatell都需要留在冰上，直到它们再悬浮于细胞中进行电镀。
3. 将50μL的细胞溶液（10000个细胞）加入到100μL的I型大鼠尾胶原的60:40比例中，在冰上生长因子还原MatMatel.用200μl吸管缓慢上下吸管，轻轻混合。< BR> 注：>
  1. 首先是胶原，然后是Matrigel。在添加细胞以避免气泡之前，不要与吸管混合。>
  2. 避免快速吸入或悬浮校准的基质混合物，以避免形成气泡。>
4. 沉积细胞/胶原/基质胶混合在冰上24孔组织培养板的中央，在37°C孵育20分钟。
5. 加至1毫升分化培养基。
6. 每2-3天更换一次介质。
7. 当细胞在基质内达到最大汇合，基质开始分解时，培养物维持长达14天。
8. 从培养的第5天开始可以看到类器官的形成（图1）。
  < BR> < IMG类＝“DoOtStWh”Src＝“//附/图像/ 20190925／209925211547×7072 .jpg”宽度＝“208”高度＝“100”ALT=“//> BR/> 图1。胶原MatRIL嵌入的SIMS细胞在第5天（A）和7（B）下扩张并形成类器官。鳞条，200μm（4X放大）。< BR>
  < BR>
类器官固定
1. 冰冷1X PBS Ca＞2 - Mg 23次。
2. 在1x PBS Ca＋2 - Mg＋2在ICE或4°C下，自由时间为20分钟时，细胞可以在任何时间点固定2%个PFA。
3. 用冰冷1X PBS Ca＞2 - Mg＞SUP> 23次。
4. 在1X PBS Ca~（2） - Mg + 2 孵育基质10分钟，重复3次，共30分钟。
5. 用镊子轻轻地从组织培养板上取出基质。< BR> 注意：如果需要多个冷冻块，可以用细刀片将基质切成2-3片。>
6. 嵌入oct（有关嵌入的完整说明，请参见Campbell等人，2011年）。注：如果浇得太快，10月份基质可能会卷曲。轻轻地倒，并用镊子固定任何卷边。>
7. 最佳切削厚度在12～16μm之间；
8. 切片可以用4% PFA、冰冷丙酮或丙酮/甲醇固定后进行染色优化。< BR>
  < BR>
三维基质染色< BR> 为了保存三维形态，在基质中嵌入1 mm×SUP＞3有机物。
1. 固定后，使用锋利的解剖刀刀片和尖镊子切割包括有机体在内的小块矩阵。在塑料盘或24孔板中分别处理每一块。
2. 如有必要，可用2-4%的pfa、丙酮/甲醇或甲醇处理基质。
3. 基质像组织切片一样进行染色。Athwal等人于2019年介绍了一个例子。
4. 根据矩阵的大小将每个样品安装在玻璃片上，间隔1-2个间隔。
5. 使用共焦显微镜捕获图像（图2）。
6. 这种染色也可在OCT嵌入的类器官基质的冷冻切片上进行（AthWal等。＞2019）。图2中的一级抗体和二级抗体的完整描述可以在上述手稿中找到。 < BR> < IMG类＝“DoOtStWh”Src＝“//附/图像/ 20190925 /209925211617Y2424.jpg”宽度＝“129”高度＝“100”ALT=“”/> BR/> 图2。1 mm 3胶原/Matrix基质，用E-cadherin固定4%个PFA后，用E-cadherin染色，< <强>鳞条，10μm < BR>

数据分析

从第3天开始拍摄布莱特菲尔德的照片，直到实验结束。使用imagej可以量化器官直径。每个实验重复3次，每天N＝5幅图像进行定量。统计分析的细节可以在我们以前的手稿中找到（AthWal[EM>等， >，2019）。

笔记

当细胞在基质中融合时，在第14天细胞死亡。
从类有机物中分离出来的细胞没有用sims细胞类有机物进行连续传代。
如果细胞数目增加，则增加胶原/基质胶的体积。
在进行三维培养分析之前，选择导入或转染的sims细胞。< BR>

食谱

sims继代培养基（表1）
< BR> 表1。sims亚培养基 < IMG类＝“DoOtStWh”Src＝“//附/图像/ 20190925／209925211958227.7.JPG”宽度＝“600”高度＝“188”ALT=“”/> BR/> < BR>
分化培养基
< BR> 表2。sims分化培养基 < IMG类＝“DoOtStWh”Src＝“//附/图像/ 20190925／20992525212021201201.JPG”宽度＝“600”高度＝“350”ALT=“”/> BR/> 注意：>
1. 制备100μl等份生长因子还原基质凝胶，并在-20°C下储存。>
2. 大鼠尾胶原100μl等分试样，保存于4°C >

致谢

这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH）/美国国立牙科和颅面研究院（NIDCR）的资助，资助项目为DE027034和DE022557。该协议适用于Maimet 等. >，2016。我们的方案描述了使用sims细胞形成有机物的时间线和培养基配方的变化。

竞争利益

没有利益冲突。

推荐信

阿斯瓦尔，H. K.，墨菲，G，第三，蒂布斯，E，CalNETT，A，Hill，E，Yeoh，K.，BelEn斯坦，E，霍夫曼，M. P.和LoBaBet，I. M. A.（2019）。SOX10调节上皮祖细胞向外分泌腺分泌单位的可塑性。干细胞报告>12（2）：366-380。
Aure，M.H.，Konieczny，S.F.和Ovitt，C.E.（2015年）。通过腺泡细胞自我复制维持唾液腺的稳态。dev cell>33（2）：231-237。
Campbell，J.J.，Davidenko，N.，Cafferel，M.M.，Cameron，R.E.和Watson，C.J.（2011）。< HREF=“HTTP//NCBI.NLM.NIH.GOV/PUMEDME/21982 437”目标=“空白”>一个多功能三维共培养系统用于乳腺组织形态发生和干细胞生物学研究。 EM：PLOS1＞6（9）：E25661。
劳德，B. M.，库蒂，Y，GASTIN，I，Sybut，C.，克勒曼，O.和Rueeon，F（1996）。< HeRF=“HTTP//NCBI.NLM.NIH.GOV/PUBMED/9013327”靶=“亚空白”＞永生化小鼠颌下腺上皮细胞系保留极化结构和功能特性。 E.J细胞SCI＞109（PT 12）：27 89～28 00。
伦巴特，I. M.，Brunsting，J. F.，Wierenga，P. K.，FabER，H.，Stokman，M. A.，Ko.T，维瑟，Pig，Y，Ye，de Haon，Yi和CoppS，（2008）。HREF=“HTTP//NCBI.NLM.NIH.GOV/PUBMED/1844 6241”靶＝“空白”>干细胞移植后唾液腺功能的损伤。 EM > PLOS1＞3（4）：E2063。
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Weng，P.L.，Aure，M.H.，Maruyama，T.和Ovitt，C.E.（2018年）。一个HREF＝“HTPF//NCBI.NLM.NIH.GOV/PUMEDME/300 89258”目标=“α空白”>严重损伤后成人唾液腺的有限再生包括细胞可塑性。 EME>细胞RP＞24（6）：1464-1470 E3。