材料和试剂

2 mm筛网（Fisher Scientific，目录号：04-881-10g）
沃特曼滤纸，1号（GE Healthcare，目录号：1001-150）
混合纤维素酯滤膜，0.22μm（Merck Millipore，目录号：GSWP04700）
聚碳酸酯膜，0.45μm（GE Healthcare，目录号：RPN303B）
2L锥形烧瓶（Duran，产品编号：212176303）
培养皿（SPL生命科学，目录号：10090）
15ml无菌试管（SPL生命科学，目录号：50015）
接种回路（SPL生命科学，目录号：90010）
尺寸为2L（内腔）和4L（外腔）的塑料容器（Berry塑料，目录号：T51368CP）
R2A肉汤（Kisanbio，目录号：MB-R2230）
营养肉汤（NB，Kisanbio，目录号：MB-N1037）
胰蛋白酶大豆汤（TSB，Kisanbio，目录号：MB-T1053）
Luria Bertani肉汤（LB，Oxoid，目录号：CM0996）
琼脂（Bio-Basic，目录号：MD01）
明胶（Sigma-Aldrich，目录号：G2500）
环己酰亚胺（Sigma-Aldrich，目录号：C7698）
DNA分离试剂盒（Instagene Matrix，Bio-Rad，目录号：7326030）
多屏PCR384滤板套件（微孔，目录号：S384PCR10）
大染料终止循环测序试剂盒（应用生物系统，目录号：4337455）
土壤快速DNA旋转试剂盒（MP生物医学，目录号：116560-200）
Qiaquick PCR纯化试剂盒（Qiagen，目录号：28104）
牛肉提取物
酪蛋白
大豆的酶消化
葡萄糖
蛋白胨
丙酮酸钠
可溶性淀粉
酵母抽提物
氯化钠
mgso4·7h2o
可可3
k2hpo4
kno3
fecl2·7h2o
（nh2）2hpo4
盐酸
cocl2·6h2o；
cucl2·2小时2o
fecl2·4h2o；
NABO3.
mncl2·4h2o；
na2moo4·2h2o；
nicl2·6h2o；
zncl2
氢氧化钠
na2seo3·5h2o；
na2wo4·2h2o；
土壤提取物（SE）（见配方）
微量元素SL-10（见配方）
亚硒酸盐（见配方）

设备

眼眶振动筛（FinePCR，型号：SH30）
漩涡（科学工业，型号：2E-179213）
多室孵化器（Han Baek Scientific，型号：HB-103-4）
双冷却系统冰箱（4°C至-18°C）（三星Zipel，型号：C23442BS300886）
离心机（Hanil Science Industrial，型号：Union 32R）
磁力搅拌器（全球实验室，型号：GLMS-G）
maestronano分光光度计（maestrogen，型号：mn-913）
多基因Optimax热循环仪（国际实验室，目录：TC9600-G-230V）
3730XL DNA分析仪（应用生物系统，目录：A41046）

软件

Microsoft Office Excel 2013和OriginPro 8.5
Mega 6.0.6（用于系统发育分析）
Lasergene Sekman Pro，版本7.1.0（44.1）（德纳斯塔尔公司）

程序

土壤取样
1. 从最上层（0-10厘米深）用无菌拉链袋收集土壤样本（每个实验装置4公斤）。
2. 用2毫米筛网筛取土壤样品。
3. 利用筛过的土壤进行DNA提取、培养和土壤提取物（SE）的制备。
  < BR>
培养基的制备
1. 按照制造商提供的说明（表1）制备r2a、tsa、lb和nb培养基。
2. 将等量的正常r2a介质和蒸馏水（d/w）混合，制备50%稀释r2a（例如1 l正常r2a介质+1 l d/w）。
3. 用硒代替D/W制备r2a-se（配方1）。
4. 用硒和表1所述的成分制备淀粉酪蛋白琼脂硒（SCA-SE）和J26-SE培养基（见配方2）。J26-SE培养基是实验室配制的培养基，其制备方法见表1。
  
  < BR>
扩散生物反应器的构建
1. 取2L塑料容器作为扩散生物反应器的内腔。
2. 如图1所示，在内腔壁上钻孔（直径6mm）。要钻孔，使用规定尺寸的电钻或螺丝刀（带加热装置）。保持孔之间8 mm的长度。
  < BR>
  图1。扩散生物反应器的设计。< /强> A塑料容器（2 L大小）贯穿孔贯穿；B. Inner腔（2L大小）与聚碳酸酯膜胶合；C示意性表示扩散生物反应器；D.使用新开发的扩散生物反应器的整体实验装置（图由Chaudhary 等< ，2019）< BR> < BR>
3. 在内腔外侧粘贴聚碳酸酯膜（0.45μm孔径）。< BR>
  < BR>
构建扩散生物反应器的实验装置
1. 将内腔放入外腔（4L塑料容器）。
2. 用泥土填满两个房间墙壁之间的空隙。
3. 将3克土壤样品与300毫升相应培养基混合，然后在内腔中加入该混合物。另外，在内腔中放置磁力搅拌器。（图1和图2）。
  < BR> < IMG类＝“DoOtStWh”Src＝“//附/图像/ 20190925／209925212711114029 .jpg”宽度＝“100”高度＝“144”ALT=“//> BR/> 图2。扩散生物反应器的实验装置<强>（Chaudhary 等< ，2019）
  < BR>
4. 用密封带封闭并密封内腔盖。
5. 在磁力搅拌器上继续搅拌（60-80rpm）扩散生物反应器并在室温下孵育4周。
6. 为每个分析培养基（r2a、tsb、lb、nb、50%r2a、r2a-sc、j26-se和sc a-se）设置类似的实验。
7. 孵育后，从扩散生物反应器中取出1毫升培养液进行取样，并连续稀释样品。对于连续稀释，使用新制备的生理盐水。
8. 在每种培养基的琼脂平板上，分别从稀释液中加入100μL连续稀释的样品（10 1 -10 7）。每展开一次，一式两份。
9. 在25℃下有氧运动培养4周。
10. 培养后，从每个培养皿中选择分离的菌落。
11. 重复传代培养（至少两次）以获得纯菌落。
12. 通过16srrna基因序列分析鉴定纯菌落。
  < BR>
pcr扩增和16srrna基因测序
1. 用dna分离试剂盒从纯菌落中提取基因组dna。
2. 使用以下引物集和条件对16srrna基因进行pcr扩增：
  底漆（Frank等人，2008年）
  向前（27F），5'-agagttttgatcmtggctcag-3'
  反面（1492R），5'-tacggytacctgttacgactt-3'
  反应混合物 30μl含20 ng基因组DNA的反应混合物< BR> PCR条件 95°C，2分钟
  35次循环：95°C，1分钟；55°C，1分钟；72°C，1分钟
  72°C，10分钟
3. 用多屏PCR384滤板试剂盒纯化PCR产物。
4. 使用3730XL DNA分析仪（应用生物系统）中的大染料终止循环测序试剂盒V.3.1（应用生物系统）对纯化的PCR产物进行测序。
  使用以下引物组进行测序反应：
  向前（518F），5′-ccagcgcgcggtaagg-3′
  反面（800R），5’-塔卡格塔特塔特塔特塔特卡特卡特卡特卡特卡特卡特卡特卡特卡特卡特卡特卡特卡特卡特卡特卡特卡特卡特卡特卡特卡特卡特卡特卡特卡特卡特卡特
5. 用seqman-pro（dnastar）软件编制16srrna基因短序列。
  
  < BR>
系统发育分析
1. 比较所有分离株的16srrna基因序列，使用blast（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi）和ezbiocloud服务器（https://www.ezbiocloud.net）（Yoon等人，2017年）。

从土壤中提取dna

按照制造商的说明，使用FastDNA旋转试剂盒（MP生物医学）从土壤样本中提取DNA。
1.5%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。
用maestronano分光光度计（maestrogen）测定提取的dna的纯度和浓度。

< BR>

PCR扩增和焦磷酸测序

使用以下引物集和PCR条件对16S rRNA基因的v1-v3区域进行PCR扩增：
底漆（Hur等人，2011年；Okubo等人，2012年）
27f:5'-cctatcctctgtgccttggcagtc-tcag-ac-gagttgattcmtggctcag-3'
518R:5'-ccatcctctcctgcgtctccgac-tcag-x-acwttaccgcgctgctgg-3'；其中'x'表示每个对象的唯一条形码。
PCR条件 30°C，5分钟
30次循环：95°C，30 s；72°C，30 s；72°C，30 s
72°C，10分钟
通过1.5%琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增子进行评估。
用qiaquick-pcr纯化试剂盒（qiagen）纯化pcr扩增子
按照制造商的说明，使用Roche/454 GS FLX钛平台对纯化的PCR产品进行热测序。

数据分析

可以使用Microsoft Office Excel 2013和OriginPro 8.5进行统计分析。通过双向方差分析估计显著性差异（p<；0.05）。
以下阈值可用于推断新的分类群：物种（99.0%≥x≥96.5%）、属（96.5%>；x≥90%）、科（90%>；x≥81.7%）、阶（81%>；x≥70%）和类（70%>；x≥65%），其中“x”表示序列相似性值（yarza等）。2008年；Kim等人，2014年）。

笔记

为了比较扩散生物反应器的效果，建立了类似条件下的传统培养实验，如图2所示。
在70%乙醇中消毒所有用于制备扩散生物反应器的成分，然后在干净的工作台上在紫外线室中干燥。
这种扩散生物反应器依靠土壤样本的类型来回收各种细菌和其他微生物。利用从特定区域采集的土壤，可以在该生物反应器中培养选择性的未培养细菌。例如，未培养的石油污染细菌可以通过使用石油污染的土壤来恢复。

食谱

土壤提取物（硒）
1. 在2L无菌D/W中混合1kg土壤
2. 在室温下以120转/分的振动速度在轨道振动筛中振动一夜
3. 静置2小时沉淀
4. 倒出并收集上清液
5. 用0.22μm薄膜过滤器过滤上清液
培养基（表1）
< BR> 表1。用于培养的培养基组成（Chaudhary等人，2019年）

*见配方3；见配方4。
< BR>
1. 加热至沸腾直至完全溶解。
2. 将pH值调整到7.2
3. 121°C灭菌15分钟；25°C时pH=7.2±0.2。
微量元素sl-10
盐酸，10毫升
cocl2·6h2o，190毫克
cucl2·2小时2o，2毫克
fecl2·4h2o，1.5g
nabo3，6毫克
mncl2·4h2o，100毫克
na2moo4·2h2o，36 mg
nicl2·6h2o，24毫克
氯化锌2，70毫克
蒸馏水，990毫升
通过0.22μm过滤器进行过滤，以进行灭菌
亚硒酸盐氢氧化钠，0.5克
na2seo3·5h2o，3mg
na2wo4·2h2o，4mg
蒸馏水，1000毫升
通过0.22μm过滤器进行过滤，以进行灭菌