材料和试剂

吸管头（10μl，300μl，1000μl）（海王星，目录号：2347；美国科学，目录号：1110-9700；海王星，目录号：2167）
Eppendorf 1.5毫升试管（VWR，目录号：87003-294）
15毫升Falcon试管（VWR，目录号：525-0449）
50毫升Falcon试管（VWR，目录号：525-0447）
培养皿（Thermo Fisher，目录号：FB0875713）
96孔微孔板（Greiner Bio One，目录号：655101）
pag415gpd ccdb载体（addgene质粒14146；http://n2t.net/addgene：14146；rrid:addgene_）
Q5？高保真2x主混音（NEB，目录号：M0492S）
SSA1-4>.-酵母菌株（Jaiswal等人，2011年）
前10名大肠杆菌（Invitrogen，目录号：C404003）
单链载体DNA（鲑鱼精子DNA，Solarbio，目录号：D8030）
胰蛋白胨（美国生物生命科学，目录号：C16050360）
氨苄西林（赛默飞世尔，目录号：1159027）
酵母提取物（美国生物生命科学，目录号：C16091364）
蛋白胨（Himedia，目录号：RM001）
葡萄糖（Vwr Amresco生命科学，目录号：0188）
琼脂（IBS科学，目录号：IB49171）
腺嘌呤半硫酸盐（Acros有机物，目录号：163631000）
酵母含氮基（美国生物生命科学，目录号：C16121501）
辍学混合减去亮氨酸、蛋氨酸、尿嘧啶（美国生物生命科学，目录号：C15050101）
辍学混合减去亮氨酸（美国生物生命科学，目录号：C15121094）
醋酸锂（LiAc）（中华药化学试剂，目录号：30109760）
聚乙二醇（PEG）（Sigma Aldrich，目录号：P3640）
0.05 g尿嘧啶（Arcos有机物，目录号：XLE-1000）
5-FOA（美国生物生命科学，目录号：16052511）
Hydroxyurea（HU）（CHEMIMPEX国际有限公司，目录号：24533）
甲基磺酸盐MMS（ACOS有机物，目录号：156891000）
氯化钠（NaCl）（VWR，AMRESCOLIFE科学，目录号：0188）
氯化镉（CdCl＜2＜/Sub＞）（ACROS有机物，目录号：42350500）
过氧化氢（H＜2＜/Sub＞O＜2＜/Sub＞）（Sigma Aldrich，目录号：216763）
氯化铜（CuCl＜2＜/Sub＞）（Sigma Aldrich，目录号：222011）
2毫升蛋氨酸（1克/100毫升）（Arcos Organics，目录号：AC166160250）（见配方）
YPDA培养基（1L）（见配方）
合成脱模板/介质（1L）（见配方）
5-FOA介质（1L）（见配方）
100 mm CuCl2的储备溶液（见配方）
CDCL储备溶液2（见配方）
化学板（见配方）
1 M liac（500毫升）（见配方）
100毫米liac（500毫升）（见配方）
50%（w/v）聚乙二醇（500毫升）（见配方）

设备

紫外线辐射器（Spectroline UV Crosslinker，型号：XEL-1000）
30°C培养箱（VWR89511-422）
37°C培养箱（VWR89511-428）
Heaul-PICO 21微型离心机（THE），目录号：75002416）
Heraeus Multifuge X1离心机系列（Thermo Fisher Scientific，目录号：75004211）
30°C恒温摇床（新不伦瑞克Excella E25）
热混合器（Eppendorf，目录号：5382EJ909137）
热块（Thermo Scientific，目录号：88870000）
热循环器（Bio-Rad，目录号：621BR26941）
用于96孔板8x6阵列的复制板（Sigma-Aldrich，目录号：r2383-1ea）
高压灭菌器（STERIS AMSCO CNETURY，目录号：SG-120）
ph读卡器（rpi，目录号：850063）

程序

Em＞Nematostella vectensis > HSP70亚型在酵母表达质粒中的克隆
1. Em＞Nematostella vectensis＞HSP70胞质亚型； NVHSP70A >， NVHSP70B >， NVHSP70D >。
2. 我们利用EMS> Nematostella > JGI基因组门户（ http://Gn.jig.doe.gov/Port/<／a>），将每个HSP70（A，B，D）的开放阅读框组装成了每个HSP70（A，B，D）。
3. NVHSP70A、B和D是从从马萨诸塞州沿海来源的 Nematostella vectensis 中分离得到的RNA合成的cDNA。< BR>
4. Q5®< /SUP>高保真2X主混合（），退火温度为60°C，延长时间为1分钟。
5. 使用了以下引物（表1）：
  < BR> 表1。用于克隆nvhsp70亚型的引物序列 < IMG类＝“DoOtStWh”Src＝“//附/图像/ 20190925／2090925252118187680.JPG”宽度＝“600”高度＝“208”ALT=“//> BR/> < BR>
6. 将pcr产物导入酵母表达质粒pag415gpd-ccdb载体中
7. 以主酵母胞质hsp70，ssa1为对照。
8. 所有插入序列用Sanger测序证实。
  < BR>
SSA1-4∏>酵母菌株
酿酒酵母含有四种胞质HSP70（SSA1-4）亚型，至少需要其中一种亚型才能存活。ssa1>.ssa2>.ssa3>.ssa4>.（ssa1-4>）pycplac33-ssa1菌株是使用loxp-kanmx-loxp>基因中断盒产生的。为了保留ssa1-4∏>菌株，需要质粒载体pycplac33-ssa1（ura3>）。有关更多应变详情，请参见（Jaiswal等人，2011年）。
< BR>
hsp70表达质粒向酵母细胞的转化
1. 在10毫升YPD中接种1个菌落（见配方），并在30°C的摇瓶中培养过夜。
2. 第二天早上，用10毫升隔夜培养液接种100毫升ypd，并在30°C（以220转/分的速度振荡）下培养，直到od600nm达到0.5。
3. 在无菌的50ml离心管中以3000x g>的速度收集培养物5分钟。
4. 倒出培养基，将细胞重新悬浮在25毫升无菌H2O中，然后再次离心。
5. 倒出h2o，将细胞重新悬浮在1.0 ml 100 mm liac中，并将悬浮液转移到无菌的1.5 ml微乳管中。
6. 以最高速度使细胞颗粒化5s，并用微量移液管移走liac。
7. 将细胞重新悬浮至500μl的最终体积，即约400μl的100 mm liac。
8. 将1.0毫升的单链载体DNA样品煮沸5分钟，并在冰水中快速冷却。
9. 旋涡细胞悬液，用吸管将50μl样品吸进标记的微乳管中。将细胞颗粒化，用微量移液管移走liac。
10. 基本的“转换混合物”由以下成分组成；按所列顺序小心添加：
  1. 240μl聚乙二醇（50%w/v）
  2. 36μl 1.0 mLiAC
  3. 25μl单链载体DNA（2.0 mg/ml）
  4. 50μl h2o和克隆的nvhsp70质粒dna（0.1-10μg）
11. 用力旋涡每根试管，直到细胞颗粒完全混合。这通常需要一分钟。
12. 将细胞悬浮液在30℃下以220转/分的速度培养30分钟。
13. 在42°C水浴中对电池悬浮液进行20-25分钟的热冲击。
14. 在冰上孵育2分钟。
15. 在5000x g下微乳15 s，并用微量移液管去除转化混合物。
16. 用移液管将0.2-1.0ml无菌h2o移到每根试管中，轻轻上下移液，重新悬浮颗粒。
  < BR>
在选择性培养基上筛选阳性酵母菌落
1. 在电镀电池之前，在30°C培养箱中加热并干燥适当的板至少30分钟。
2. 转化后，将酵母细胞散布在添加适当营养素的合成脱落培养基（SD，配方2）上，以选择质粒，并在30℃下培养2天。
3. 将菌落划线至新鲜sd板上，并在30℃下至少培养1天。
4. 从先前的酵母细胞到含有5-氟-乳清酸（5-foa，配方3）的sd培养基，对基于ura3>的覆盖载体进行反选择。
5. 如果突变的或非本地的hsp70不足以保持细胞作为唯一的亚型存活，细胞将不会在含有5-foa的培养板上生长。
6. 此时，细胞可能会重新划线并保存在YPD培养基上。由于hsp70质粒是生存所必需的，因此无需将其保留在sd-leu上。
  
  < BR>
不同处理对hsp70功能性的影响
1. 如果非本地HSP70能够在正常条件下（30°C）作为细胞的唯一HSP70亚型提供必要的功能，我们可以通过观察细胞对不同应激源（包括热应激（37°C））的抵抗来进一步表征HSP70的功能。dna损伤（羟基脲）、氧化应激（h2o2）、nacl（渗透胁迫）、紫外辐射、cdcl2和cucl2（重金属暴露）。
2. 表达nvhsp70亚型作为其唯一胞浆hsp70的ssa1-4△em>细胞在10ml ypda的50ml试管中生长到对数中期（od600nm=0.5）。
3. 在透明的96孔板中连续稀释10倍（全浓度、1/10浓度、1/100浓度和1/1000浓度）。
4. 将细胞复制到含有上述化学物质或正常YPDA培养基的固体YPDA培养基上，然后暴露于非生物胁迫，包括37°C和UV辐射的热应力（150 JM 2 ，200 JM 2 ）。
5. 药物浓度为：Hu（200 mm和300 mm），MMS（0.04%，0.08%），NaCl（0.8 m，1 m），CdCl 2 < /Sub >（30 mm，45 mm），CuCl＜2＞/Sub＞（3 mm，4 mm，4 mm），H＜＜＜/Sub＞O<＞＜/Sub＞（mm，mm）。
6. 细胞干燥后，所有培养皿（37°C培养皿除外）在30°C培养箱中倒置保存3天。
7. 应使用正常YPDA（保持在30°C）上的细胞复制板控制板来比较酵母中非天然亚型与化学板上非天然亚型的“正常生长速率”，见图1。< BR> < BR> < IMG类＝“DoOtStWh”Src＝“//附/图像/ 20190925 /201992523 23 46909037 JPG”宽度＝“339”高度＝“100”ALT=“”/> BR/> 图1。在酵母中表达NVHSP70（Waller等人，2018年）。NVHSP70异构体在酵母中提供必需的HSP70功能。EMS> SSA1～4 E/EM>细胞用表达质粒pAG415ccDB、SSA1表达或NVHSP70亚型表达质粒转化，然后连续稀释到缺乏亮氨酸或含有5-FA的培养基上。细胞在5-FA上的生长显示NVHSP70亚型在细胞中表达HSP70时的基本功能。将培养板在30℃下培养3天，然后拍照。

数据分析

应在观察到细胞生长模式后（通常在3天后）拍摄平板照片（见图1）。

笔记

虽然这一方案描述了HSP70亚型的表达和分析，但它也可以用于分析HSP70磷酸化位点功能，如杜鲁门（E.E>等人，＞2012），或允许使用表位标记的版本分析HSP70的全球相互作用（如杜鲁门等.>，2015A和2015B；奈顿等人，2019年）

食谱

50%（w/v）聚乙二醇（500毫升）
在300毫升DDH中溶解250g聚乙二醇<亚> 2 O
添加ddh2o，直到最终体积为500 ml
在121.0°C下进行高压灭菌，液体循环1小时
1米liac（500毫升）
在300毫升DDH中溶解51克醋酸锂2o
添加ddh2o，直到最终体积为500 ml
pH至7.5
在121.0°C下进行高压灭菌，液体循环1小时
100毫米锂离子电池（500毫升）
将1 M LiAC稀释10倍
在121.0°C下进行高压灭菌，液体循环1小时
YPDA介质（1 L）
800毫升ddh2o
10g酵母提取物
20克蛋白胨
20克葡萄糖
40毫克腺嘌呤
添加20 g琼脂（仅用于平板）
添加ddh2o使体积达到1l
倒入适当大小的瓶子中
121.0°C高压釜，液体循环1小时
在室温下冷却并干燥一夜
合成脱模板/介质（1 L）
800毫升ddh2o
6.7克ynb
20克葡萄糖
1.62g滴剂混合物-LEU
0.05克腺嘌呤
用氢氧化钠（如果低于6）将pH值调整到6.0
添加20 g琼脂（仅用于平板）
加入反渗透水至1L
倒入适当大小的瓶子中
121.0°C高压釜，液体循环1小时
在室温下冷却并干燥一夜
5-FOA介质（1 L）
6.7克ynb
20克葡萄糖
1.47 g-ura、-leu、-met滴度
0.05克尿嘧啶
2毫升蛋氨酸
加入20g琼脂，使之达到1L
121.0°C高压釜，液体循环1小时
蒸压后，搅拌时稍微冷却，然后添加1g FOA
浇注板
在室温下冷却并干燥一夜
100 mm CuCl2的储备溶液测量0.166 g cucl2并与15 ml水混合
cdcl储备溶液2
测量1.67克CDCL2并与15毫升水混合
化学板
羟基脲（hu）>
1. 测量0.76 g HU，与50 ml液体YPDA（冷却至接触）轻轻混合，并倒入两个培养皿中。
2. 在室温下冷却并干燥一夜
  < BR>
彩信>
1. 测量0.02毫升MMS，与50毫升液体YPDA（冷却至接触）轻轻混合，并倒入两个培养皿中，制成0.04%MMS
2. 测量0.04毫升MMS，与50毫升液体YPDA（冷却至接触）轻轻混合，倒入两个培养皿中，制成0.08%MMS
3. 在室温下冷却并干燥一夜
< BR> cucl>2>
1. 从100 mm CuCl2储备溶液中测量出1.5μl，并与50 ml液体YPDA（冷却至接触）混合，制成3.0 mm浓度，并倒入两个培养皿中
2. 从100 mm CuCl2储备溶液中测量出2μL，并与50 ml液体YPDA（冷却至接触）混合，使浓度达到4.0 mm，然后倒入两个培养皿中
3. 从100 mm CuCl2储备溶液中测量出2.5μl，并与50 ml液体YPDA（冷却至接触）混合，制成5.0 mm浓度，并倒入两个培养皿中
4. 在室温下冷却并干燥一夜
< BR> cdcl>2>
1. 从cdcl2储备溶液中量出15μl并与50 ml液体ypda（冷却至接触）混合并倒入培养皿中
2. 从cdcl2储备溶液中量出22.5μl，与50 ml液体ypda（冷却至接触）混合，并倒入培养皿中；
3. 在室温下冷却并干燥一夜
  
  < BR>
h>2>o>2>
1. 加入40μl H2O2并与50 ml YPDA（冷却至接触）混合，使浓度为0.8 mm，并倒入两个培养皿中。让它冷却一夜
2. 加入50μl h2o2并与50 ml ypda（冷却至接触）混合，使浓度为1 mm，并倒入两个培养皿中。让它冷却一夜
3. 加入75μl h2o2并与50 ml ypda（冷却至接触）混合，使浓度为1.5 mm，并倒入两个培养皿中。让它冷却一夜
4. 在室温下冷却并干燥一夜
  
  < BR>
NaCl>
1. 测量2.34 g NaCl并与50 ml YPDA（冷却至接触）混合，使浓度为0.8 m，并倒入两个培养皿中
2. 测量2.92 g NaCl并与50 m YPDA（冷却至接触）混合，使浓度为1.0 m，并倒入两个培养皿中
3. 在室温下冷却并干燥一夜

致谢

本研究得到了美国国立卫生研究院NCI R15CA20873（AWT）和国家科学基金会NDF DEB1545 539和RUU 1359271（AMR）的支持。我们感谢杜鲁门和雷泽尔实验室的同事，他们提供了帮助、见解和评论，极大地帮助了研究和手稿。本方案改编自我们之前的工作（Waller等人，2018年）。

相互竞争的利益

这份手稿的作者声明没有相互竞争的利益。

工具书类

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奈顿，L.E.，尼蒂卡，沃勒，S.J.，斯特罗姆，O.，沃尔夫盖尔，D.，雷泽尔，A.M.和杜鲁门，A.W.（2019年）。热休克条件下线虫体HSP70亚型相互作用体的动态重塑。j蛋白质组学>206:103416。

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