材料和试剂

吸管尖端0.1-10μl、1-200μl、100-1000μl（Sorenson Bioscience，目录号：70600、70520、70540）
移液管0.5-10μl、10-100μl和100-1000μl（Eppendorf，目录号：13-684-251）
薄壁、超净13.2毫升、14 x 89毫米超离心管（贝克曼库尔特，目录号：344059）
厚壁，38毫升，25 x 89毫米离心管聚碳酸酯（贝克曼库尔特，目录号：355631）
厚壁，70毫升，38 x 102毫米聚碳酸酯离心瓶（贝克曼库尔特，目录号：355655）
Eppendorf安全锁管，1.5毫升（Eppendorf，目录号：022363204）
50毫升锥形管（Denville Scientific，目录号：C1062-P）
formvar？-镀铜网格（电子显微镜科学，目录号：fcf300-cu-sc）
滤纸（VWR28313-068）
无菌细胞过滤器40μm（Fisher Scientific，目录号：22-363-547）
毛细管和塑料盖（马尔文，目录号：DTS 1070）
蛋白质定量分析试剂盒（Bio-Rad，目录号：5000002）
磷酸盐缓冲盐（康宁，目录号：21-040-cv）
模拟肠液（RICCA化学品，目录号：7109-16）
模拟胃液（RICCA化学品，目录号：7108-16）
乙酸铀酰（电子显微镜科学，目录号：22400-4）
云母片（电子显微镜科学，目录号：71855-15）
蔗糖（Calbiochem，目录号：8510）（见配方）
蔗糖梯度（8，30，45，60%）（见配方）
1%醋酸铀酰溶液（见配方）

设备

榨汁机（布雷维尔，型号：BJA200XL）
Sorvall St 16R离心机（Thermo Fisher Scientific，产品目录号：75004381）
最佳超速离心机（Beckman Coulter，目录号：969349）< BR>
转子：
1. J-Lite系列JLA 16.250 16000转/分（贝克曼库尔特，序列号O8U 3761）
2. 45型Ti 45000转/分（贝克曼库尔特，序列号99E.2785）
3. sw 32 ti 32000转/分（贝克曼库尔特，序列号11u 2963）
Zetasizer（马尔文，型号：Nano-ZS90）
粒度分析仪（Brookhaven Instrument Corps，型号：90plus）
原子力显微镜仪器（精工仪器公司，型号：SPA400）
透射电子显微镜（卡尔蔡司，型号：LEO 906E）
Milli-Q Advantage A10净水系统（Millipore Sigma，产品目录号：C10117）
半微量试管，清除1.5毫升（西格玛，目录号：BR79115）
超声波浴（布兰森，产品目录号：3510mth）
荧光微板阅读器（BioTek，模型：增效2）
pH计（SPER Scientific，目录号：860031）
-80°C冷冻柜（如此低，型号：PV85-21）

程序

隔离（见注1）（图1）
注：从1公斤生姜中获得的GDNPS 2的近似量为50-100ng/ml。
1. 用自来水彻底清洗1公斤大致去皮的生姜。
2. 用搅拌机把姜片研磨成汁。
3. 在3000℃下离心约550毫升生姜汁，在RT.为20 min。
4. 再次在10000x g下离心2小时，以去除大纤维。
5. 收集上清液并将（~45毫升）均匀地分配到12个70毫升容量的试管中。
6. 将收集到的上清液在4°C、150000x g>下超离心2小时（使用45 Ti 45000 RPM型）。超速离心管6管两次。
7. 超声波分散法去除5毫升PBS中的上清液并悬浮在各管中。在适当的吸液之后，所有的纳米颗粒都应该悬浮在PSC溶液中。如果不溶性颗粒存在，可以使用细胞过滤器在梯度离心前除去不溶性颗粒。< BR> < BR> < IMG类＝“DoOtStWh”Src＝“//附/图像/ 20190925 /201992525828×2525.jpg”宽度＝“158”高度＝“100”ALT=“//> BR/> 图1。生姜汁提取。生姜切片在榨汁机中挤压得到果汁，进行纳米颗粒分离纯化。
  
  < BR>
提纯
1. 从上到下按8%、30%和45%的顺序制备12个38.5毫升容量的试管，每个试管装满10毫升蔗糖溶液。
2. 将5 mL的PBS悬浮颗粒从每个管子转移到12个管中的不连续蔗糖梯度（8%，30%，45%（克/体积）），在4℃下用SWT 32钛转子，150000 x g > 2小时（见配方1）。超速离心管6管两次。
3. 从8/30%和30/45%界面分别收集~2 ml的带2和~0.6 ml的带1，方法是将吸管尖端轻轻浸入蔗糖梯度溶液中（见数据分析）。
4. 在4°C，100000x g>下对收集的带进行离心45分钟（使用45 Ti 30000转/分型），去除上清液。
5. 用1毫升PBS洗净球团，除去剩余的蔗糖，然后用超声波分散法将球团悬浮在1毫升PBS中。
6. 使用蛋白质定量分析试剂盒（遵循制造商手册）和微孔板阅读器在750 nm的吸光度下测量获得的gdnp（0.25~1.25 mg/ml）的浓度。< BR> 注：由gdnps所含的蛋白质被用来定量gdnps。该测定是基于蛋白质与酒石酸碱性铜溶液和Folin reagent（DC蛋白测定说明书）的反应。蛋白质通过损失1, 2或3个氧原子而影响福林试剂的还原，从而产生几种可能的还原物种中的一种或多种，它们具有特征性的蓝色，在750 nm处具有最大的吸光度。颜色的发展主要是由于氨基酸酪氨酸和色氨酸基团。 >
7. 对于短期储存（少于3个月），gdnp可以悬浮在pbs中并储存在-80°c下。长期稳定性尚未测试（只有波段2用于表征；丢弃波段1）。
  < BR>
  图2。蔗糖梯度超速离心。将gdnps加入8%、30%、45%蔗糖梯度中，超速离心纯化。
  
  < BR>
特性（GDNPS 2）
1. 在体外测试纳米粒子的稳定性（见注6）
  注：在sgf/igf中孵育前后测量粒径和zeta电位进行比较。>
  1. 将1毫升纳米粒（1毫克/毫升）加入9毫升模拟胃液（SGF）中，并在单独的试管中模拟肠液（SIF）。
  2. 通过倒置管子彻底混合。
  3. 将0.2毫升混合物稀释成1.8毫升PBS。
  4. 培养前测定粒径和zeta电位（遵循以下步骤c2和c3）。
  5. 将混合物在37°C水浴中培养30分钟。
  6. 培养后测定粒径和zeta电位。
2. 测量粒度（步骤c1d和c1f的说明，参见数据分析，图2）
  1. 将0.2毫升混合物稀释成1.8毫升PBS。
  2. 小心地将所有稀释后的混合物加入反应杯中，不要有气泡。
  3. 将反应杯插入粒子分析仪室。
  4. 确定颗粒的大小。
3. 测量zeta电位（步骤c1d和c1f的说明，参见数据分析，图1）
  1. 小心地将0.8毫升混合物添加到毛细管细胞中。
  2. 用塑料盖盖住毛细管。
  3. 将电池插入zeta电位分析仪的室中。
  4. 在中性ph下测定样品的数量。
4. 获取透射电子显微镜（tem）图像（图5）
  1. 将一滴样品沉积在FormVar涂层网格的表面上。
  2. 在样品顶部加入1%醋酸铀酰，等待15秒（见配方2）。
  3. 小心地用纸巾吸收样品和醋酸铀酰，不要接触表面。
  4. 在室温下干燥样品5分钟。
  5. 用透射电子显微镜扫描样品图像。
5. 获取原子力显微镜（AFM）图像（图6）
  1. 将1μl纳米颗粒样品沉积在云母片上。
  2. 在室温下干燥样品。
  3. 用2.5μl蒸馏水轻轻冲洗云母片三次。
  4. 在室温下再次干燥样品。
  5. 把它放在样品变平之前。
  6. 扫描面积约4x 4μm，高度2-50nm。

数据分析

蔗糖梯度超离心法显示两条带，分别为8/30%（带1）和30/45%（带2）。利用光子相关光谱（PCS）测量了GDNP的尺寸分布和zeta电位。带2的平均粒径约为115.8nm（图3）。对于波段2，在ph 6时zeta电位的近似值为~12mv（图4）。透射电子显微镜（tem）和原子力显微镜（afm）分析也证实了稳定gdnp的成功分离和表征（图5和图6）。gdnps 2的体外稳定性试验证实了纳米颗粒在胃肠道等恶劣环境中的耐受性。精确测量gdnps 2的粒径和zeta电位，保证其作为稳定的药物载体在人体内的应用。此外，tem和afm还研究了gdnps 2的机电功能性，这对生物材料的表征至关重要。< BR> < BR>
图3。测量第2波段生姜纳米颗粒的大小。近似纳米颗粒的半径为~115.8nm。
< BR>
图4。用malvern-zetasizer测得的zeta电位在ph 6时约为-12mv。
< BR>
图5。gdnps 2的透射电镜图像 < BR>
图6。gdnps 2的afm（原子力显微镜）图像

笔记

用0.22μm滤膜过滤蔗糖溶液，去除细小颗粒。
预热水浴至37°C。
使用前，确保粒度分析仪和Zetasizer至少平衡15分钟。
避免在用于尺寸和zeta电位测量的反应杯中产生气泡。

食谱

蔗糖梯度（8,30,45%）
1. 将每8，30，45克蔗糖粉溶解在70毫升蒸馏水中，然后使体积达到100毫升
2. 用移液管将每种蔗糖溶液按顺序从底部移取；45%、30%和8%。对于5ml的生gdnps悬浮液，使用10ml 8%、10ml 30%和10ml 45%蔗糖溶液。在38毫升容量的试管中填充30毫升蔗糖梯度
1%醋酸铀酰溶液
1. 将4g醋酸铀酰粉末溶解于100ml预热（50-60°C）过滤水中，制备4%醋酸铀酰储备溶液
2. 将1毫升4%醋酸铀酰原液稀释成3毫升过滤水

致谢

这项工作得到了国家糖尿病、消化和肾脏健康研究所（Ro1-DK-107739&Ro1-DK-116306 to D.M）和退伍军人事务部（奖励BX002526 to D.M）的支持。D.Merlin是退伍军人事务部（BX004476）颁发的高级研究职业科学家奖的获得者。EV是来自克罗恩和结肠炎基金会的职业发展奖的获得者。本方案改编自Zhang等人（2016年）发表的著作。

相互竞争的利益

作者声明作品中没有利益冲突。

工具书类

Chen，Q.，Xiao，B.和Merlin，D.（2017年）。用于治疗炎症性肠病的纳米疗法。专家修订版胃肠肝功能学>11（6）：495-497。

肖，B.，马，L.和梅林，D.（2017）。纳米粒子介导的化疗药物和sirna联合应用于癌症治疗。专家OPin药物递送>14（1）：65-73。

Zhang，M.，Viennois，E.，Prasad，M.，Zhang，Y.，Wang，L.，Zhang，Z.，Han，M.K.，Xiao，B.，Xu，C.，Srinivasan，S.和Merlin，D.（2016年）。食用生姜纳米粒：预防和治疗炎症性肠病和结肠炎相关癌症的新方法。生物材料>101:321-340。

Zhang，M.，Wang，X.，Han，M.K.，Collins，J.F.和Merlin，D.（2017年）。口服含sirna的生姜源性纳米脂质作为有效sirna药物递送治疗溃疡性结肠炎的新方法。纳米药物（lond）>12（16）：1927-1943。