材料和试剂

60 ml注射器（HENKE SASS WOLF，货号：8300006680）
0.2 µm无菌过滤器（Sarstedt，目录号：83.1826.001）
防护服（实验室外套，护目镜，手套）
带有凸头套筒和脱水缸夹具的支架（Bochem，目录号：5000、5300、5401）
250毫升滴液漏斗（Buhler，NS29 / 32）
水浴用耐热碗
耐热2.5升瓶
0.5或1 L圆底烧瓶（Schott Duran，NS 29/32，目录号：2172154）
无菌塑料0.5升瓶（Corning ® Costar ®，Nunc®T175无涂层PS烧瓶）
50 ml锥形离心管（Sarstedt，目录号：62.547.004）
氨溶液（25％NH 4 OH）（EMD密理博，目录号：1.05432）
乙醇（99％C 2 H 6 O）（Riedel-deHaёn，目录号：34963）或更低等级
盐酸（发烟的37％HCl）（Roth Chemicals，目录号：4625.1）
氯化铁（II）4-水合物（≥99％FeCl 2 •4H 2 O）（Honeywell / Fluka，目录号：44939）
氯化亚铁（≥98.5％FeCl 3 ）（Roth Chemicals，目录号：5192.3）
甲基丙烯酸（≥99％C 4 H 6 O 2 ）（Merck，目录号：155721）
过硫酸钾（≥99％K 2 S 2 O 8 ）（默克（Merck），目录号：216224）
十二烷基硫酸钠（NaC 12 H 25 SO 4 ）（Merck，目录号：L3771-100G）
氢氧化钠（≥99％NaOH）（Roth Chemicals，目录号：6771.1）
原硅酸四乙酯（≥99％Si（OC 2 H 5 ） 4 ）（默克（Merck），货号：86578）
2 M NaOH（请参阅食谱）
0.1 M HCl（请参阅食谱）
Fe2 / 3溶液（请参阅配方）

注意：在使用这些化学品之前，请查阅适当的MSDS信息！始终使用实验服，手套和护目镜！这些化学药品也可以从其他供应商处获得。没有优先权给指定的供应商。

设备

通风柜
真空过滤系统（康宁，目录号：UD-29530-02）
加热磁力搅拌器（Heidolph，目录号：504-10000-00）
磁力搅拌棒
坚固的钕永磁体（例如，钕圆盘磁体80 x 10毫米N45级粘结力〜300千克-使用此类强磁体时要格外小心！）

程序

还提供了以下所有书面协议的流程图（图3）。

图3. BOMB MNP协议。用于合成MNP核心颗粒（灰色）及其用二氧化硅（黄色）或羧基（绿色）涂层的协议工作流程。

MNP的BOMB合成
注意：所有程序都可以在惰性氩气气氛下进行（或者将高纯度N2吹扫系统30分钟就足够了。我们通常在大气氧水平下进行反应，但是在使用前进行脱气和加热溶液）。
1. 通过使用真空过滤系统过滤NaOH溶液使之脱气-在磁力搅拌下保持真空运行1小时。
2. 根据图1A组装圆底烧瓶，滴液漏斗和水浴，并将其放在磁力搅拌器上。向底部的收集瓶中加入100 ml脱气的2 M NaOH，将Fe2 / 3溶液添加至滴液漏斗。将装有2 M NaOH溶液的烧瓶加热到80-85°C。
  注意：使用新鲜制备的Fe2 / 3溶液和正确的铁盐对于反应成功至关重要。否则，如在洗涤步骤或储存珠粒时所观察到的那样，形成的铁沉淀可能导致MNP的稳定性降低。
3. 将60 ml Fe2 / 3溶液滴加到100 ml预热（80-85°C）2 M NaOH溶液中，同时剧烈搅拌（> 400 rpm）。
  注意：Fe 3 O 4 （FeO•Fe 2 O 3 ）的黑色沉淀为形成。
4. 加入完全的Fe2 / 3溶液后，向反应混合物中加入10ml的25％氨溶液。再搅拌30分钟，然后冷却至室温。
5. 将溶液转移到无菌的塑料容器中，并磁性沉淀黑色沉淀物（MNP），弃去上清液。
  注意：含氨的垃圾需要适当地丢弃。
6. 重悬于200 ml的ddH 2 O中，磁性沉淀并弃去上清液。重复进行总共5次洗涤（或直到洗涤液的pH值达到〜7）。
7. 最后一次洗涤后，将MNP重悬于30-40 ml的ddH 2 O中，并转移到新的50 ml试管中。
  注：要测量合成产率，请磁性沉淀MNP，除去水并称重产品的湿质量。或者，将沉淀的MNP在液氮中速冻，然后冻干并测量干质量。 N2或氩气环境中的冻干MNP可以在RT的密闭容器中存放更长的时间。湿的MNP随时间缓慢氧化；因此，我们建议在一周内涂上它们。
BOMB二氧化硅涂料
注意：所有程序均可在惰性N2气氛或大气氧气条件下执行。该协议在两种情况下均适用，但是，在N2气氛下工作时，可以减少或消除棕色沉淀物（氧化铁）的形成，因此，可以提高未涂层微珠的稳定性。
1. 使用磁力搅拌器（300-400 rpm）在耐热的2.5 L瓶中将2 L的99％乙醇与50 ml的25％氨溶液和〜22.5 g（湿质量）的合成氧化铁MNP（A）混合。打开加热开关，让溶液加热到约80°C。
  注意：将核心颗粒有效地分布在溶液中非常重要。否则，大分子的MNP会被二氧化硅覆盖，导致珠子在核酸捕获应用中的性能下降。
2. 在不断搅拌下加入45 ml正硅酸四乙酯（TEOS），再孵育30分钟。
  注意：可以使用不同比例的核心粒子和TEOS来控制粒子的大小。上述方案中使用的标准比例为：1 g顺磁性核颗粒与2 ml TEOS，这导致平均粒径约为400 nm。通常，更多的TEOS会产生更大的珠子。
3. 向溶液中加入400 ml的ddH 2 O。
4. 使反应进行＆gt;。 4小时（最好是一夜）。
  注意：TEOS在水中自发水解，这将导致白色二氧化硅沉淀，其中不含顺磁性核。如果大量这种沉淀物形成，请使用新鲜的TEOS进行反应。
5. 将溶液冷却至室温。
6. 使用坚固的钕磁铁分离镀膜的MNP。
  注意：未包被的MNPs随时间逐渐被氧化，这通过磁分离后上清液的棕色表示。
7. 用纯水洗涤两次。
8. 用纯乙醇洗涤两次。
9. 用纯水洗涤，直到溶液的pH值变为中性（3-4倍）。
  注意：要测量合成产率，请用磁珠法沉淀二氧化硅珠，除去水并称重产品湿重。包被的珠子可以在室温下保存至少一年。
BOMB羧基涂料
注意：所有程序均可在惰性N2气氛或大气氧气条件下执行。该协议在两种情况下均适用，但是，在N2气氛下工作时，可以减少或消除棕色沉淀物（氧化铁）的形成，因此，可以提高未包覆珠粒的稳定性。
1. 在圆底烧瓶中使用磁力搅拌器（300-400 rpm）将1 g（湿质量）的合成氧化铁MNP（A）分散在45 ml水中和1.15 g十二烷基硫酸钠与200 ml纯化的脱气水混合）。打开加热开关，让溶液加热到约70°C。
2. 向烧瓶中加入0.96毫升甲基丙烯酸（MAA）。
  注意：pH值降至约3。
3. 保持温度平衡反应混合物约45分钟。
4. 向溶液中加入1.98 g引发剂过硫酸钾。
5. 让聚合反应在约70°C下进行2小时。
6. 将溶液冷却至室温。
7. 通过用强钕磁铁浓缩MNP并丢弃上清液，将包被的MNP与游离的MAA和PMAA分离。
  注意：未包被的MNPs随时间逐渐被氧化，这通过磁分离后上清液的棕色表示。
8. 将分离的顺磁性纳米粒子分散在去离子水中（例如，在超声波浴中），然后按照步骤C7所述进行磁萃取。
9. 用ddH 2 O清洗珠子至少5次，或直到洗涤剂完全除去，然后将它们分散在250 ml的ddH 2 O中。
  注意：要测量合成产率，请用磁珠法沉淀二氧化硅珠，除去水并称重产品湿重。包被的珠子可以在室温下保存至少一年。
标定BOMB顺磁珠
可以通过电子显微镜（TEM，SEM）以及有限程度的光监控核心颗粒合成的成功以及包衣反应显微镜（LM）。所得的显微照片显示在图1C，1D和1E中。成功的合成应主要产生单个球形珠，当暴露于强磁场中时，球形珠显示顺磁性并成簇。如果相应的应用需要此信息，还可以使用X射线粉末衍射（XRD）评估微珠的其他性能。但是，对于诸如核酸提取之类的标准应用，这不是必需的。
我们还建议对每个合成珠的性能进行基准测试，并测试它们在较长时间下的存储性能。为此，我们建议按照DNAB协议＃4.1（ https://bomb.bio/protocols ）。此外，我们建议将每个应用程序的结果与可用的商业设置进行比较。在BOMB协议＃4.1中也可以找到有关如何执行此操作的协议。
用BOMB顺磁珠纯化核酸
合成的珠子已针对多种先前发布的方案进行了广泛测试（Oberacker et al 。，2019）。在这里，我们显示了从 E提取核酸的示例性结果。大肠杆菌（图2A），HEK293细胞（图2B）和各种哺乳动物组织（图2C）使用上述硅珠。所有协议都可以在BOMB.bio主页上公开获得（ https://bomb.bio/protocols ）。

数据分析

以上显示的所有数据都可以在PLOS Biology的原始论文的支持信息中找到（Oberacker et al 。，2019）。

菜谱

2 M NaOH
溶于水
可以在室温下保存至少12个月
0.1 M HCl
从储备溶液中稀释水
可以在室温下保存至少12个月
Fe2 / 3溶液（新鲜配制）
3.24克FeCl 3 （0.333 M）
2.00克FeCl 2 •4H 2 O（0.167 M）
加入60 ml 0.1 M HCl，并通过磁力搅拌溶解，并使用60 ml注射器用0.2 µm注射器过滤器进行无菌过滤

致谢

作者要感谢初次发表的所有撰稿人对BOMB项目的贡献以及采用顺磁珠进行核酸纯化的方案的开发。我们还要感谢广大的研究社区提供了有关顺磁珠制备和实用性的未公开信息和资源。
＆nbsp; 作者的贡献：这个想法是由TPJ和TH构思的。合成规程的设置和优化由TPJ完成。 PS，DB和PO提供了核酸提取数据以及光学显微镜分析。电子显微镜分析通过KH进行。手稿由PO，TPJ和TH撰写。所有作者都为稿件的编辑做出了贡献，并批准了稿件的最终版本。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

Aggarwal，A.，Saxena，R.，Wang，B。和Caneba，G.T。（1996）。通过自由基逆向沉淀聚合过程进行甲基丙烯酸聚合的研究。 J Appl Polym Sci 62（12）：2039-2051。
Choi，J.，Kim，J.C.，Lee，Y.B.，Kim，I.S.，Park，Y.K.和Hur，N.H.（2007）。使用高度光致发光的镧系元素探针制备涂有二氧化硅的磁性纳米粒子。 Chem Commun（Camb）（16）：1644-1646。＆nbsp;
DeAngelis，M.M.，Wang，D.G.和Hawkins，T.L.（1995）。固相可逆固定化以分离PCR产物。核酸Res 23（22）：4742-4743。
Hawkins，T. L.，O'Connor-Morin，T.，Roy，A.和Santillan，C.（1994）。使用固相进行DNA纯化和分离。核酸研究 22（21）：4543-4544。
Houshiar，M.，Zebhi，F.，Jafari，Z.，Alidoust，A. and Askari，Z.（2014）。钴铁氧体（CoFe 2 O 4 ）使用燃烧，共沉淀和沉淀方法的纳米颗粒：尺寸，结构和磁性的比较研究。 J Magn Magn Mater 371：43-48
Kim，J.W.，Kim，L.U.和Kim，C.K.（2007）。二氧化硅纳米粒子的尺寸控制及其在牙科纳米复合材料制造中的表面处理。生物大分子 8（1）：215-222。
Majidi，S.，Sehrig，F.Z.，Farkhani，S.M.，Goloujeh，M.S.和Akbarzadeh，A.（2016）。目前合成磁性纳米颗粒的方法。 Artif Cells Nanomed Biotechnol em> 44（2）：722-734。
Oberacker，P.，Stepper，P.，Bond，DM，Hohn，S.，Focken，J.，Meyer，V.，Schelle，L.，Sugrue，VJ，Jeunen，GJ，Moser，T.，Hore，SR ，冯·梅恩（Fon Meyenn），F。，希普（Kipp），TA。生物磁珠（BOMB）：用于高通量核酸提取和纯化的开放平台 PLoS Biol 17（1）：e3000107。
Rohland，N.和Reich，D.（2012年）。用于多重目标捕获的高性价比，高通量DNA测序文库。 Genome Res 22（5）：939-946。
Singh，D.，McMillan，J.M.，Liu，X.M.，Vishwasrao，H.M.，Kabanov，A.V.，Sokolsky-Papkov，M.和Gendelman，H.E.（2014）。配方设计有助于将磁性纳米颗粒输送到患病的细胞和组织。纳米医学（ Lond） 9（3）：469-485。
Stöber，W.，Fink，A。和Bohn，E。（1968）。在微米尺寸范围内控制单分散二氧化硅球的生长。 J胶体科学与技术杂志（26）（1）：62-69。
Wu，W.，Wu，Z.，Yu，T.，Jiang，C. and Kim，W.S.（2015）。磁性氧化铁纳米颗粒的最新进展：合成，表面功能策略和生物医学应用。 Sci Technol Adv Mater 16（2）：023501。