材料和试剂

玻璃盖玻片24 x 50毫米，第1.5号（Globe science inc 。，目录号：1415-15）
镊子
加湿室（Biolegend，目录号：SIG-31031）
科普林缸
幻灯片染色碟（IHC WORLD，目录号：IW-2511）
幻灯片染色架（IHC WORLD，目录号：IW-2512）
二甲苯（Fisher Scientific，目录号：HC7001GAL，22-110-676和X16-4）
异丙醇（Fisher Scientific，目录号：A416-4）
EnVision FLEX目标提取溶液，高pH（50x）（Dako Omnis，代码号：GV804）
Tris-HCl（Sigma-Aldrich，目录号：T5941）
NaCl（Sigma-Aldrich，目录号：S9888）
吐温20（Sigma-Aldrich，目录号：BP337）
海卫一X-100（Sigma-Aldrich，目录号：X100）
NaN 3 （Fisher Scientific，目录号：S2271-25）
正常山羊血清（Sigma-Aldrich，目录号：G9023）
牛血清白蛋白（BSA）（Sigma-Aldrich，目录号：A7030）
Tris Base（Fisher Scientific，目录号：BP152-5）
抗γ-微管蛋白（1：100，Sigma-Aldrich，目录号：T5326）
Anti-Pericentrin（1：200，Abcam，目录号：28144）
Anti-CEP135（1:50，Abcam，目录号：ab75005）
Anti-Centrin-3（1：100，亚诺法，目录号：H00001070-M01）
Anti-CP110（1：100，Proteintech TM ，目录号：12780-I-AP）
抗E-钙黏着蛋白（1：100，Abcam，目录号：ab76055 M168）
二抗，从Jackson Immunoresearch购买，以1：200使用
Hoechst 33342（1：1,000; Invitrogen，目录号：H3570）
ProLong ®钻石防褪色封固剂（Thermo Fisher Scientific，目录号：P36970）。
EDTA（Fisher Scientific，目录号：BP120-500）
FFPE组织的洗涤缓冲液（请参见“食谱”）
FFPE组织的封闭缓冲液（请参见食谱）
抗原检索缓冲液（请参见配方）
用于抗原提取（pH 9.0）的Tris-EDTA缓冲液（请参见食谱）

设备

热风烤箱（Labnet ProBlot TM 6杂交烤箱）
通风柜
驱油室或高压锅（Biocare medical，DC0228）
配备Olympus IX71相机（CoolSNAP HQ2；光度法）的高分辨率荧光显微镜（DeltaVision Core系统（GE Healthcare Bio-Sciences，匹兹堡，美国））
注意：由于质心很小（长度为0.5μm），并且可以根据细胞周期而紧密定位，因此需要高分辨率（200 nm左右）的高分辨率图像才能准确分离每个质体。可以使用高分辨率显微镜，例如共聚焦和反卷积显微镜。我们已成功检测到个人使用反卷积显微镜（DeltaVision）的60倍，NA 1.42物镜的中心体。由于中心体的位置因组织类型而异，因此需要通过整个细胞体积的Z切片图像来检测和测量单个细胞内不同z切片中的大多数中心粒。

软件

图像采集软件（softWoRx v1.2软件[应用科学]）
Adobe photoshop（ https://www.adobe.com/products/photoshopfamily.html ）
ImageJ或斐济（Schindelin等，2012； Schneider等，2012）。

程序

FFPE组织样本染色
注意：＆nbsp;＆nbsp;
1. 组织切片应切成5至10μm的厚度。将组织切得太薄会导致细胞体积减少和中心体的假阴性检测。最佳厚度应根据所使用的特定组织样本确定。
2. 对于每个部分，我们建议使用H＆amp; E染色部分作为指导幻灯片，以识别感兴趣的区域。
1. 组织准备。时间：〜1小时。
  在热风烤箱中于65°C烘烤薄纸1小时或过夜。
  注意：根据组织的厚度，实验会有所不同。
2. 去石蜡。时间：约25分钟。
  1. 将组织玻片浸入装有100％新鲜二甲苯的Coplin广口瓶中，在通风橱中于室温下放置7分钟。
  2. 重复步骤2a两次，共3次。
3. 补液。时间：〜45分钟。
  1. 在通风橱中于室温将载玻片在装有100％异丙醇的Coplin广口瓶中孵育7分钟两次。
  2. 在通风橱中于室温下将载玻片在装有70％异丙醇的Coplin广口瓶中孵育7分钟。
  3. 在通风橱中于室温下将载玻片在装有50％异丙醇的Coplin广口瓶中孵育7分钟。
  4. 将玻片在装有ddH 2 O的Coplin广口瓶中于室温孵育7分钟两次。
  注意：在进行下一步之前，可以将载玻片在ddH 2 O中于室温保存过夜。
4. 抗原检索。时间：〜1小时。
  注意：这可能会因所使用的设备而异。
  1. 将500毫升去离子水或过滤后的水添加到一个隐蔽室或高压锅中。
  2. 将200毫升新鲜制备的抗原回收缓冲液添加到载玻片染色皿中，然后将载玻片浸入抗原回收缓冲液中。
  3. 使用另一个装有200 ml ddH 2 O的载玻片染色皿平衡分离室的平衡。
  4. 关闭去泄漏室的盖子并旋转，以确保将去泄漏室正确密封。打开去污室，将玻片在全压下孵育20分钟。对于脱色室（Biocare Medical，DC0228），其设置为大约103 kPa / 15 psi，在全压下它将达到大约120°C的温度。
  5. 完全释放压力并冷却后，打开去掩蔽室。
  6. 将载玻片转移到加湿室中，然后通过在每张载玻片的顶部放置一滴洗涤缓冲液在室温下孵育5分钟，将载玻片在洗涤缓冲液中孵育5分钟。
    注意：
    1. 在全压下解锁室是危险的。在打开之前，必须完全释放压力。
    2. 从这一步开始，幻灯片不要变干是非常重要的。确保在加湿室中执行以下所有步骤。
5. 阻塞时间：〜30分钟
  1. 通过将幻灯片水平放置，使标签面向研究者的方式轻轻地敲击幻灯片，然后点击底部边缘以去除多余的液体。
  2. 用100μl封闭缓冲液覆盖组织切片。
  3. 轻轻地在组织的顶部放一块盖玻片，使液体均匀铺开，并在室温下孵育载玻片30分钟。
    注意：在继续操作之前，可以将载玻片在4°C的封闭缓冲液中过夜。
6. 一抗孵育。时间：隔夜。
  注意：这可能会因实验而异。
  1. 取下盖玻片，然后轻轻点击载玻片以清除多余的液体。
  2. 在封闭缓冲液中用100μl稀释的抗体覆盖组织切片。
  3. 轻轻地在组织的顶部放一块盖玻片，使液体均匀铺开，并在4°C下孵育玻片过夜。或者，组织玻片可以在室温下于一抗中孵育1小时。
    注意：一抗的稀释度可能会因目标而异。最佳抗体浓度应根据具体情况确定。我们已经成功地染色了不同的中心体标记。一抗和稀释液可以在“材料和试剂”中找到。为了量化每个细胞的中心体数量，研究者应相应选择中心体标记物和细胞边界标记物。为了同时染色不同的靶标，研究人员应该选择在不同物种中产生的抗体。例如，我们已经成功地将CEP135（兔）标记为中心粒，将E-Cadherin（小鼠）标记为不同组织类型中的上皮细胞边界（图1A）。
7. 二级抗体孵育。时间：45分钟至1小时。
  1. 通过在每个载玻片的顶部放置一滴洗涤缓冲液以覆盖组织，将盖玻片和载玻片在洗涤缓冲液中洗涤3次，在室温下各5分钟。
  2. 在封闭缓冲液中稀释第二抗体。对于每个组织玻片，建议使用100μl封闭缓冲液。
  3. 取下盖玻片，然后轻轻点击载玻片以清除多余的液体。
  4. 在封闭缓冲液中用100μl稀释的抗体覆盖组织切片。
  5. 轻轻地在组织的顶部放一块盖玻片，使液体均匀铺开，并在室温下孵育30分钟至1小时。
    注意：为共同染色不同的标记物，研究者应根据所用的一抗和显微镜上可用的滤光片组选择与不同荧光团偶联的二抗。例如，使用配备有FITC，TRITC和DAPI滤镜组的显微镜将E-钙黏着蛋白（小鼠），CEP135（兔）和DNA一起成像。我们将Alexa-488山羊抗小鼠用于E-钙黏着蛋白（小鼠），将Alexa-568山羊抗兔用于CEP135（兔子）。二抗的稀释度可以变化。我们已经成功地使用了Invitrogen的Alexa TM 偶联的，高度交叉吸收的二抗，稀释度为1：200。仅用二抗染色的样品可用作阴性对照，以提高分析的稳定性。
8. 复染色。时间：〜30分钟。
  1. 取出盖玻片并在洗涤缓冲液中洗涤载玻片3次，在室温下每次5分钟。
  2. 在室温下用Hoechst（1：1,000; 10 µg / ml）在PBS中复染20分钟。
  3. 通过在每个载玻片的顶部放置一滴洗涤缓冲液以覆盖组织，在洗涤缓冲液中将载玻片洗涤两次，在室温下各5分钟。
9. 安装。时间：24小时
  1. 使用ProLong ® Diamond Antifade Mountant固定组织切片，并在室温下黑暗中存放过夜，以使固定剂固化。
    注意：避免在组织区域中出现气泡。您可以在盖玻片上添加一滴封固剂，然后将盖玻片倒置以覆盖组织切片。
  2. 固化后用指甲油密封。
    注意：封固剂固化后第二天对样品成像，或储存在-20°C以便将来分析。保护样品避光。样品可以在-20°C下保存，并避光保存一年以上。＆nbsp;
影像学
1. 使用低倍物镜（例如，10x，NA 0.7）查找感兴趣的区域。
2. 使用高倍物镜（例如，例如，60x，N.A 1.42油）以Z截面对从步骤B1定义的感兴趣区域进行成像。使用细胞-细胞连接标记（例如，E-Cadherin）查找整个细胞体积，并将Z形切片的厚度设置得足以覆盖整个组织切片。我们已经成功地在DeltaVision Core系统上使用0.2微米间隔的Z切片在不同焦平面上分离了中心体，其物镜为60倍，NA 1.42。将图像导出为.tiff格式，然后再执行dara分析。
  注意：可以使用共聚焦或反卷积显微镜等高分辨率显微镜系统对目标区域成像。请注意，共聚焦显微镜使用针孔来阻挡z平面中的散焦光，而反卷积显微镜则使用计算方法在捕获图像后去除散焦光。由于每种反卷积方法都应针对成像系统上的每个物镜专门生成，因此我们仅使用通过softWoRx在DeltaVision核心系统上生成的反卷积文件。
  最近发表了使用该协议显示组织中中心体数量定量的代表性图（Wang等人，2019a，Wang等人，2019b）。可以在我们已发表的论文的图2中找到它们（Wang等人，2019b）。

数据分析

使用从高分辨率显微镜拍摄的Z截面图像来量化每个细胞的中心体数量。

使用ImageJ或Fiji通过“图像”下的“堆栈”打开Z形截面图像。
如果导入为多通道RGB图像，请使用“图像”→“颜色”→“分割通道”分隔每个通道。
调整每个通道的对比度和亮度，以减少背景并增加信号强度。调整每个通道后合并所有通道。
注意：亮度和对比度的调整应该是线性的，并且应谨慎使用这些变化，而不会丢失或过饱和信号。
使用命令“图像”→“堆栈”→“ Z项目”生成最大强度投影。使用此最大强度投影图像查找带有中心体的区域，并检查细胞是否在Z维度上重叠。如果图像中没有重叠的细胞或中心体，研究人员可以使用最大投影来量化每个细胞的中心体。如果发生重叠，请转到步骤5。
进行Z形截面以使用中心体标记（例如，CEP135病灶）和细胞边界标记（例如，E-钙黏着蛋白）手动量化每个细胞的中心体数目。
注意：根据组织类型和样品切片，组织中的细胞可以在不同的焦平面上重叠。如果细胞在不同的焦平面上相互重叠，则不应使用Z截面图像的最大投影图像来量化单个细胞的中心体。

笔记

组织固定对于染色结果至关重要。请勿使用过度固定的组织或重新固定先前已冷冻的组织样本。
为了练习该程序并测试特异性抗体，我们建议使用人类扁桃体组织，因为它包含许多不同的正常细胞类型。
组织切片的厚度对于准确定量每个细胞的中心体数量至关重要。切片组织过薄可能会导致细胞体积减少和假阴性结果。组织样本太厚会导致细胞重叠。根据组织质量和组织类型，我们建议仔细测试适当的组织切片厚度，以避免组织丢失或重叠细胞的并发症。 5或10μm的厚度是一个很好的起点。
保持所有试剂无菌。

菜谱

FFPE组织的清洗缓冲液
0.1 M Tris-HCl
0.3 M氯化钠
0.1％吐温20
7.7 mM NaN 3
在25°C下将pH调节至7.6。
要制成50毫升的储液，：
1. 向烧杯中加入5 ml 1 M Tris-HCl，5 ml 5 M NaCl，50 ul Tween 20和0.025 g NaN3，然后加入ddH 2 O
2. 在室温下将pH调节至7.6
  注意：补间20是粘性的。添加Tween 20时，请缓慢移液以免气泡进入移液器吸头。也可以切割移液器吸头的末端以方便操作。洗涤缓冲液可以无限期地在室温下保存。
FFPE组织的封闭缓冲液
5％（v / v）正常山羊血清（NGS）
0.1 M Tris-HCl
0.15 M NaCl
7.7 mM NaN 3
在25°C下将pH调节至7.6
要制成50毫升的储液，：
1. 向烧杯中加入5 ml 1 M Tris-HCl，5 ml 5 M NaCl，2.5 ml NGS和0.025 g NaN 3 和ddH 2 O。
2. 在室温下将pH调节至7.6。阻断缓冲液可以无限期地在室温下保存。使用前先加热至室温
  注意：NGS可以用5％（w / v）牛血清白蛋白（BSA）取代，具体取决于所用的一抗。如果一抗是在山羊体内产生的，则需要将封闭剂改为BSA。
抗原提取缓冲液
将50倍的EnVision FLEX目标检索溶液稀释到ddH 2 O
注意：如果要染色少于24个切片（载玻片的数量可能因使用的载玻片架的不同而异），则可以在200毫升ddH 2 滑动罐中的O。未使用的稀释溶液可以在2-8°C下保存一个月。
Tris-EDTA缓冲液抗原提取（pH 9.0）（1x）
注意：此缓冲液是该方案的替代抗原回收缓冲液。
10 mM Tris Base
1 mM EDTA解决方案
0.05％吐温20
在25°C下将pH调节至9.0
制造100毫升10倍储液
1. 向烧杯中加入1.21 g Tris Base，0.37 g EDTA和0.5 ml Tween 2和100 ml ddH 2 O
2. 充分混合并在室温下将pH调节至9.0。将此溶液储存在4°C

致谢

我们感谢美国国家癌症研究所（NCI）P30CA23074，该研究所提供了组织获取和分子分析服务的研究支持服务。这项工作还得到了美国国立卫生研究院（NIH）的资助，R01GM110166和R01GM126035授予了GCR，NIH-NCI RO1CA159406授予了AEC，Tim和Diane Bowden癌症生物学研究奖学金授予了MW。（PMID：30699045）研究一种在人类正常组织和癌症组织中以单细胞水平定量中心体的方法。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

我们通过UA癌症中心提供的组织获取和分子分析服务研究核心（TACMASR）访问了组织。 UA癌症中心是NCI指定的综合中心，并得到P30 CA 23074的支持，该中心根据NCI政策利用最佳实践管理核心服务。样本/数据是无法识别的，并且是从提供者那里获得的，而该提供者被机构法规委员会监督和批准的既定法规或政策禁止发布标识符。

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