材料和试剂

动物
雄性Wistar大鼠（3至4个月大，350-400克）
注意：
1. 需要执行机构动物伦理协议批准才能执行本协议中所述的程序。建议使用个人防护装备。
2. 如果大鼠是从其他来源获得的，请在进行手术前让它们适应新的菌落至少3天。
3. 在我们的实验室中，观察到体重不足300 g的老鼠在注射icv-STZ后更容易失去体重。
4. 在这里我们推荐雄性大鼠，因为雌性大鼠对STZ诱导的认知障碍的敏感性低于雄性大鼠（Bao等人，2017）。此外，与在人类中观察到的相比，雌性大鼠在某些AD典型生物标志物中表现出差异。但是，在Sprague-Dawley大鼠中观察到了这些差异。为了更好地了解激素调节如何影响疾病的进展，需要更多的研究来测试与其他啮齿动物物种和品系中与AD易感性和进展有关的性别差异。由于AD在女性中比男性更普遍，因此STZ模型通常仅应用于雄性啮齿动物这一事实限制了该模型的代表性（Bao et al。，2017）。
STZ和车辆准备
1. 锅铲（Sigma-Aldrich，目录号：Z648299）
2. 烧杯50毫升（Qualividros，货号：59930）
3. 移液器吸头0.1-10 µl（VWR，目录号：53509-138）
4. 微量离心管0.5 ml（Eppendorf，目录号：0030124537）
5. STZ（圣克鲁斯生物技术，目录号：sc-200719）
6. 柠檬酸钠（Sigma-Aldrich，目录号：W302600）
7. 氯化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S7653）
8. 盐酸（Sigma-Aldrich，目录号：320331）
9. 氢氧化钠（Sigma-Aldrich，目录号：S8045）
10. 双蒸馏水
11. 0.05 M柠檬酸盐缓冲液（请参阅配方）
手术
1. 铝箔
2. 剪刀（Roboz，货号：RS-6700）
3. 组织钳（Roboz，目录号：RS-8166或RS-5242）
4. 缝合针（Aspen Surgical，Richard-Allan ®针，目录号：200016）
5. 缝合线（Braunamid，目录号：F1185047）
6. 棉纱布（Fisherbrand，目录号：22-362178）
7. 微量移液器（Gilson Inc.，目录号：F81022）
8. 1 ml注射器（BD，货号：309628）
9. 22 G针（BD，货号：305159）
10. 25 G针（BD，目录号305122）
11. 24 G静脉导管（Terumo，目录号：SR-OX2419CA）
12. 聚乙烯管PE-10（Scientific Commodities Inc.，目录号：BB31695-PE / 1）
13. 微量注射器10 µl（汉密尔顿，目录号：80300）
14. 氯胺酮（Syntec）
15. 赛拉嗪（Syntec）
16. （可选）利多卡因和肾上腺素
17. 五生物（Zoetis）
18. 酮洛芬（Ceva）
19. 无菌注射用水（复方）
20. 聚维酮碘酒精溶液（Aurora制药，目录号：19004）

设备

蜕皮升降机（Roboz，货号：RS-8830）
持针器（精细科学工具，目录号：12010-14）
分析规模（Marte，型号：ATX 224）
pH计（Marte，型号：MB10）
小动物秤（Bonther，型号：LS5）
宠物理发器（Amplavet，货号：950042）
立体定位仪（Kopf，型号：900）
加热垫（PhysioSuite®，Kent Scientific，目录号：PS-02）
牙钻（Bonther，型号：BL 2000）
输液泵（Insight设备，型号：Bi2000，目录号：EFF 311）
-20°C冰箱（VWR，型号：SCBMF-2020）
高压灭菌器（Prismatec，型号：CS）

软件

Sigma Plot 11或Statistica 7.0

程序

手术设置
1. 消毒所有手术工具。
2. 按照“食谱”中的说明准备柠檬酸盐缓冲液。
3. 在专用的手术室中，放置所有用于手术的材料和设备。
4. 测量并记录每只大鼠的体重。
5. 在微量离心管中，根据其体重分别称量每只大鼠所需的STZ量。例如，对于350 g的大鼠，称重1.05 mg的STZ，随后将其在6 µl柠檬酸盐缓冲液中稀释。尽管仅注射了4 µl的这种溶液（每侧脑室2 µl），相当于2 mg / kg的剂量，但我们建议您准备更大体积的溶液。
  注意：STZ对健康有害，需要个人防护设备。 STZ溶液的半衰期非常短（15-30分钟），并且不稳定。溶液应在使用前新鲜配制。
6. 用铝箔覆盖微量离心管，以保护STZ免受光照。
7. 用STZ为每个微量离心管加上相应的大鼠识别号。
8. 将装有STZ的微量离心管保持在-20°C。
9. 准备显微注射系统。为此，使用钻头切开24 G静脉导管，使STZ注射针长15毫米。将STZ注射针连接到PE-10管的末端（长40厘米）。在PE-10管路中注入注水，并将另一端连接到与输液泵相连的10 µl微型注射器。
  注意：始终确保微量注射系统没有堵塞。将输液泵设置为以1 µl / min的速度运行。
静脉注射STZ（见图2和3）
注意：手术应在无菌条件下进行。我们建议在手术过程中用盐水或滴眼液润滑大鼠的眼睛。
1. 用氯胺酮（90 mg / kg）和甲苯噻嗪（10 mg / kg）联合麻醉，均使用25 G针头和1 ml注射器腹膜内给药。
  注意：确保大鼠完全麻醉并且对可能的疼痛刺激无反应非常重要。您可以通过按大鼠尾巴的尖端或后爪的底部来检查其反应能力。如果大鼠在注射5分钟后出现任何反应，则必须将氯胺酮强化至初始剂量的50％。
2. 将大鼠放在加热垫上方的立体定位仪中，并保持直肠温度在37°C左右。
3. 分别使用22 G和25 G针和1 ml注射器管理五生物素（48,000 UI，肌内注射）和酮洛芬（5 mg / kg，皮下注射）。
4. 剪断头部背侧区域，并用聚维酮碘酒溶液清洁指定用于手术的区域。
  注意：要非常小心，不要刮掉毛刺。
5. 使用组织钳和剪刀，在矢状缝线（约2厘米长）上切开头皮，然后切开骨膜以露出头骨。使用Molt电梯可以帮助完成此过程。
  注意：可选地，可以在切口前大约1分钟皮下注射由2％利多卡因和肾上腺素（1：200,000）组成的局部麻醉剂，以减少出血。
6. 立体定向icv注射是在同一水平面上用b和λ进行的。为此，请检查lambda和bregma的背腹轴。 λ和前reg前腹轴之间的差异小于0.2 mm表示大鼠头部的正确位置。
7. 在颅骨上钻两个小孔，正好大到可以让STZ注射针穿过颅骨并按照从前reg处测得的坐标穿过大脑表面，到达侧脑室：前后轴-0.8 mm，在中外侧轴上为±1.4毫米，在背腹轴上为-3.6毫米（Paxinos et al。，2005年）。
8. 使用微量移液器，将柠檬酸盐缓冲液添加到先前在微量离心管中称重的STZ中，然后将其匀浆，将溶液吸入并分配到微量离心管中两次。
  注意：预计STZ溶液呈现淡黄色，由于NO的释放，几乎看不到气泡。 STZ溶液应在使用前新鲜制备。
9. 吸出1 µl空气，然后使用先前放置在立体定位设备的臂中的STZ注射针吸出STZ溶液，该臂连接到自动显微注射系统。 1 µl的空气将在STZ溶液和填充PE-10管的水之间形成气泡。
10. 顺着侧脑室坐标，缓慢降低大鼠大脑内部的STZ注射针，使其穿过颅骨孔之一。
11. 通过以1 µl / min的速度启动输液泵2分钟来启动icv-STZ注射。因此，应在每个侧脑室中注入2 µl STZ溶液。
  注意：监视沿着PE-10管通过气泡路径的注射流量。
12. 注射结束时，请等待2分钟，以从大脑侧脑室中抽出STZ注射针，以防止STZ溶液倒流。
13. 对另一侧脑室重复相同的步骤。
14. 在STZ注射完后，在大脑的两个侧脑室缝合皮肤。
15. 对于对照大鼠，完全按照步骤B9-B14所述，在大脑的每个侧脑室中注入2 µl柠檬酸盐缓冲液代替STZ。
  注意：对于柠檬酸盐缓冲液注射，请使用与STZ注射不同的注射针和PE-10管。
16. 皮下注射3 ml生理盐水以补充大鼠水分。
17. 让大鼠在单独的笼子中恢复至少3天。
  注意：应对大鼠进行持续观察，直到从麻醉中恢复过来（约一小时），并在手术后的第一周进行。应每天评估生理参数，例如体重，食物和水的摄入量，以及与疼痛和不适相关的行为。如有必要，可以在主管兽医的建议下给予补充喂养以及其他止痛，抗炎和抗生素药物。遭受不可逆转的疼痛和体重减轻的大鼠应被安乐死。与对照组相比，注射Icv-STZ的大鼠可能更难以从手术中恢复。
18. 将老鼠放回殖民地。
  
  图2.注射程序的设置。 A.用于STZ注射手术的主要设备和工具。 B.微量注射系统：带有微型注射器的输液泵，其连接到PE-10管的一端。 C.立体定向器械（侧视图），STZ注射针连接到PE-10管的另一端，如箭头所示。 D.手术工具和牙钻。
评价大鼠的认知能力
注意：由于AD在人类中的主要特征是具有多种认知缺陷，因此为确保AD动物模型模仿疾病的大部分方面，认知测试对于检测动物的记忆缺陷至关重要。对于此处描述的STZ模型，我们建议仅在手术完全恢复后才进行行为测试，当动物达到与手术前一天相近的体重值并呈现完全健康状态时（手术后大约一周）。
根据所使用的认知测试，可以观察到早期缺陷，但是大多数研究通常在手术后一个月进行行为和组织病理学分析，此时可以观察到AD的大多数模仿方面，例如磷酸化tau蛋白和心室扩大（Knezovic et al。，2015; Moreira-Silva et al。，2018）。在这个AD模型中，可以通过执行以下任务来评估几种类型的内存不足：巴恩斯迷宫，物体位移和用于空间记忆的莫里斯水迷宫；径向和Y型迷宫用于工作记忆;抑制性规避，高架迷宫中的逃避潜伏期以及用于情绪记忆的恐惧条件和用于识别记忆的新物体识别。某些行为任务的完整描述可以在我们小组先前发表的研究中找到（Moreira-Silva et al。，2018，用于在高架迷宫和Motzko-Soares等，2018年，适用于Barnes和Y型迷宫）。此外，我们的研究小组先前已经描述了由icv-STZ注射诱导的AD生物标志物存在的组织病理学和分子分析（Moreira-Silva等，2018年，Motzko-Soares等）。，2018年）。

图3.注射程序的设置示意图（A）和立体定位仪中大鼠头部的俯视图（B）。在B中，红色表示大鼠的剪切区域。头。前reg后的两个棕色点表示为插入icv注射针而钻孔的大致位置。

数据分析

通常，行为测试需要大量的实验动物。我们建议实验编号为＆gt;每组10只大鼠。我们实验室的数据显示出正态分布，并通过参数测试（例如学生的 t 测试以及使用Sigma Plot 11或Statistica 7.0软件的单向或双向方差分析）进行了评估。有关每个组和测试的数据分析和实验编号的详细说明，可以在“ 数据处理和分析/统计分析”部分以及莫雷拉-希尔瓦的图例中找到。 et al。（2018），Motzko-Soares et al。（2018）和Vicente et al。（2018）。图4显示了通过icv注射STZ（2 mg / kg）诱导的行为（A）和组织病理学（B-D）改变，作为手术后进行测试的例子。在注射icv-STZ的大鼠的几种脑结构中观察到β-淀粉样蛋白表达增加和Tau过度磷酸化（Santos等人，2012； Knezovic等人。 >，2015； Dehghan-Shasaltaneh 等人，2016）。

图4.接受icv注射STZ（2 mg / kg）的Wistar大鼠的行为和组织病理学分析。 A。icv-STZ注射在Escape潜伏期测试中的效果通过升高的迷宫（EPM）。手术后30天，与媒介物治疗的大鼠相比，经STZ治疗的大鼠的逃避潜伏期增加，表明情绪记忆受损。逃生潜伏期的计算公式为：（在测试中找到闭合手臂的时间/在训练中找到闭合手臂的时间）x100。有关逃生潜伏期测试协议，请参见原始出版物。数据以平均值±标准误差表示（每组n = 11至12只大鼠）。 B.手术后40天，经STZ和媒介物治疗的大鼠的前房后室1.56 mm处的心室面积（mm 2 ）。与媒介物处理的大鼠相比，icv-STZ注射增加了侧脑室面积，表明神经变性。数据表示为平均值±SE。 C和D。显示车辆和icv-STZ组的侧脑室的代表性组织学图像。右图示意性地表示了从左起的组织学图的形状，填充有与相应组中使用的每个样品的心室面积相对应的彩色斑点（每组n = 3-5）。 *表示 P ≤0.05（学生的 t 检验）。 LV：侧脑室； CC：Corp体。 A-D改编自Moreira-Silva等人（2018）。

菜谱

0.05 M柠檬酸盐缓冲液
1. 在烧杯中转移40毫升蒸馏水
2. 向溶液中添加0.735 g柠檬酸钠（分子量：294.1 g / mol）
3. 向溶液中添加0.450 g氯化钠（分子量：58.4 g / mol）
4. 使用HCl或NaOH将溶液调节至最终pH值为4.5
5. 加入蒸馏水将体积调节至50毫升
6. 高压灭菌溶液并保持在4°C
注意：在室温下使用柠檬酸盐缓冲溶液。

致谢

作者感谢圣保罗研究基金会（FAPESP）的财政支持（TMSM的大学研究金2017 / 12648-6，DM-S的大学研究金2014 / 14661-1和2016 / 24773-7以及201325503-5和201601836 -3授予RCLV;研究资助金2015 / 02991-0授予MCA，2015 / 23426-9授予DCC），CNPq（研究资助429894 / 2016-3授予TLF，449102 / 2014-9授予DCC），CNPq（资助429894 / 2016年3月； 449102 / 2014-9）和美国农业银行联邦大学（UFABC）。

利益争夺

作者宣称没有任何金融和非金融竞争利益。

伦理

所有程序均由美国农业银行联邦大学动物使用伦理委员会（CEUA-UFABC）批准，规程008/13。

参考文献

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