材料和试剂

高轮廓切片机刀片818（Leica Biosystems，Germany，目录号：14035838926）
显微镜载玻片（美国，Globe Scientific，目录号：GS-1308）
骆驼毛刷
注射器柱塞
1.5 ml微量离心管（USA Scientific，目录号：1615-5500）
液体阻滞剂Pap笔（Sigma Aldrich，目录号：Z377821）
新鲜解剖的小鼠后肢胫前肌
Myh fast 2A抗体（Developmental Studies Hybridoma Bank，目录号：2F7）
Myh fast 2B抗体（爱荷华州爱荷华州，Developmental Studies Hybridoma Bank，目录号：10F5）
Myh慢速（1型）抗体（发展研究杂交瘤银行，爱荷华州爱荷华州，目录号：A4.840）
生物素化绵羊抗小鼠IgG抗体（Abcam，目录号：ab6807）
Tissue-Tek最佳切割温度（OCT）化合物（Sakura Finetek，美国，目录号：4583）
异戊烷（Alfa Aesar，目录号：19387，CAS号：78-78-4）
液氮
牛血清白蛋白（BSA）（瑞士罗氏，目录号：10711454001）
正常绵羊血清（NSS）（Sigma-Aldrich，目录号：S22）
吐温20（RPI Corp.，USA，目录号：P20370，CAS号：9005-64-5）
4'，6-二dia基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）（Invitrogen，目录号：D1306）
ProLong金牌防褪色解决方案（Invitrogen，目录号：P10144）
链霉亲和素Alexa Fluor 488偶联物（Invitrogen，目录号：S-11223）
磷酸二氢钠
磷酸氢二钠
37％甲醛（Sigma-Aldrich，目录号：252549，CAS号：50-00-0）
Milli-Q水
阻止混合物（请参见食谱）
稀释剂（请参见配方）
10％福尔马林缓冲液（请参阅食谱）
1x PBS中的0.2μg/ ml DAPI（请参阅食谱）
1x磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.4（请参阅食谱）

设备

旋转低温恒温切片机（CM1950，德国徕卡生物系统公司）
轨道振动筛（德国Boeco，参考号：BOE 8069200）
配备Leica DFC 310 FX相机的Leica CTR 6500显微镜
低温恒温器

软件

图片J（斐济， https://imagej.nih.gov/ij/ ）

程序

样品制备
1. 解剖后肢胫骨前肌并除去周围的结缔组织。
2. 握住肌肉的腱侧，将组织放在注射器柱塞的平坦侧。
3. 用OCT化合物覆盖组织，然后将其浸入液氮冷却的异戊烷中30-40 s，以立即冻结组织。
4. 将冷冻的组织保存在-80°C以便将来使用。
5. 在保持在-20°C的低温恒温器中，在肌肉的中腹部区域切割10μm横向连续部分。
6. 在用刷子冷冻切片的同时支撑切片，并通过将载玻片（保持在室温下）非常靠近切片的方式挑选切片。
肌肉切片的免疫染色
1. 用液体阻断笔在组织部分周围画一个周长。这有助于将载玻片上的多个组织切片染色，也可以减少所需的稀释剂体积。
2. 将新鲜制备的封闭溶液（最低200μl/节）添加到切片上以完全覆盖它，并在室温下于低速轨道振荡器上孵育一个小时。
3. 用稀释剂在单独的1.5 ml微量离心管中准备Myh fast 2A，Myh fast 2B和Myh slow（I型）一抗的1:25稀释液，并在低速轨道振荡器上于4°C孵育过夜。
4. 用1x PBS清洗切片3次，每次5分钟，以除去结合到切片上的非特异性抗体。
5. 用10％的福尔马林缓冲液固定一抗染色5分钟，然后用1x PBS洗涤3次，每次5分钟。建议（特别是对于DSHB MyHC一抗），在孵育一抗之前不要进行固定，因为这会破坏一抗与冷冻切片中不同MyHC的有效结合。因此，在一抗孵育步骤后进行固定。
6. 将稀释液中稀释的生物素化绵羊抗小鼠IgG二抗1：200稀释液在室温下摇动孵育一小时。
7. 用1x PBS清洗切片3次，每次5分钟，然后用1：400稀释的链霉亲和素Alexa Fluor 488偶联三抗在0.2％BSA和0.1％PBS-Tween 20（1x PBS中制成的0.1％Tween 20）中孵育1次在黑暗中室温下放置一个小时。
8. 用1x PBS清洗切片两次，每次5分钟。
9. 用在以1：5,000稀释的1x PBS中制成的DAPI将肌核染色5分钟，然后用1x PBS彻底冲洗。
10. 将幻灯片完全风干，以使用ProLong Gold防褪色贴壁剂溶液进行安装，并使其在黑暗中干燥过夜。
11. 使用配备有Leica DFC 310 FX摄像机的Leica CTR 6500荧光显微镜在FITC通道下进行可视化，激发波长为488 nm，发射波长为536 nm。

数据分析

为了量化所使用的每种抗体（Myh fast 2A，Myh fast 2B和Myh slow（I型））的阳性肌纤维数量，将图像导入ImageJ（斐济），并对每个抗体染色部分的明亮染色的肌纤维计数。可以在原始研究文章Rao et al。，2019中的图7中找到此示例，在本手稿中再次将其提及为图1.这些值表示为平均肌纤维数±SE两种动物的显着性水平是用两尾学生的 t 检验与野生型肌肉进行比较（*** P <0.001）（Rao et al。，2019）。

图1.在Akirin1基因敲除（Aki1 -/-）和野生型（WT）上显示不同类型的MyHC（I型，IIa型和IIb型）染色胫骨前肌切片（改编自Rao等人，2019年）。

菜谱

封闭混合物
0.5％的Triton X-100
0.2％BSA
10％NSS
1x PBS
稀释剂
0.2％牛血清白蛋白
5％NSS
0.1％吐温20（1x PBS制成）
10％福尔马林缓冲液 class =“ ke-zeroborder” bordercolor =“＃000000” style =“ width：500px;” border =“ 0” cellspacing =“ 0” cellpadding =“ 2”> <身体>一元磷酸钠
4克
磷酸氢二钠
6.5克
37％甲醛
100毫升
Milli-Q水
900毫升
1x PBS中的0.2μg/ ml DAPI
1. 使原料浓度为1 mg / ml DAPI
2. 取2μl的原液，并用1x PBS补足10 ml。
1x磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.4
class =“ ke-zeroborder” bordercolor =“＃000000” style =“ width：500px;” border =“ 0” cellspacing =“ 0” cellpadding =“ 2”><身体>蒸馏水
800毫升
氯化钠
8克
氯化钾
0.2克
磷酸氢二钠
1.44克
磷酸二氢钾
0.24克
用HCl调节pH值至7.4
补足到1 L

致谢

这项工作得到了资助机构的支持：BMRC 07/1/21/19/521，NMRC / EDG / 0026/2008和启动资金。作者感谢新加坡国立大学在博士期间为Vanitha V. Rao提供的奖学金。作者承认原始研究文章Rao et al。，2019年首次从中讨论了该协议。

利益争夺

作者宣称没有任何金融和非金融竞争利益。

伦理

原始研究文章中使用的动物位于新加坡南洋理工大学动物馆。所有实验均按照新加坡机构动物伦理委员会批准的规程进行，批准号为ARF-SBS / NIE-A0270。

参考文献

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Rao V.V.，U.Sangiah，Mary，K.A.，Akira S.和Mohanty，A。（2019年）。 Akirin1在调节骨骼肌纤维类型转换中的作用。 J细胞生物化学。 doi：10.1002 / jcb.28406。
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