材料和试剂

带滤帽的细胞培养瓶，25 cm 2 （Thermo Fisher Scientific，目录号：156367）
细胞培养瓶，塞子密封盖，25 cm 2 （Greiner Bio-One，目录号：690160）
96孔平底组织培养板（Sarstedt，目录号：83.3924.005）
细胞刮板（Sarstedt，目录号：83.1830）
方形玻璃罩（VWR，目录号：6311570）
封口膜（Bemis，目录号：HS234526B）
移液器吸头：0.5-10 µl，10-200 µl，200-1,000 µl（Greiner Bio-One，目录号：771291、739290、740290）
多通道移液器储液器（品牌，目录号：BR703411）
褶状滤纸（Sigma-Aldrich，目录号：WHA1201150）
1.5 ml微量离心管（Greiner Bio-One，目录号：616201）
血清移液管2 ml，5 ml，10 ml（Sarstedt，目录号：86.1252.001，86.1253.001，86.1254.001）
注射器5毫升（BD翡翠，目录号：307732）
无菌注射器过滤器0.22 µm（Millipore，目录号：SLGVV255F）
婴儿利什曼原虫前鞭毛体（zymodeme GH8，菌株MHOM / GR / 2001 / GH8）
大利什曼原虫前鞭毛体（zymodeme LV39，品系MRHO / SU / 59 / P）
永生化巨噬细胞系J774A.1（ATCC；美国罗克维尔/ ATCC编号：TIB-67）
总酚含量（TPF）（来自希腊克里特岛扎罗斯地区农业合作社的特级初榨橄榄油）
不含L-谷氨酰胺的RPMI 1640（Biowest，目录号：L0501）
施耐德的昆虫培养基（Biosera，目录号：LM-F0702）
L-谷氨酰胺（Biosera，目录号：LM-R1641）
HEPES缓冲液1 M（Biowest，目录号：L0180）
青霉素-链霉素溶液10,000 U / ml（Biowest，目录号：L0022）
二甲基亚砜（DMSO）细胞培养等级（PanReac Applichem，目录号：A3672,0050）
无水乙醇（Sigma-Aldrich，目录号：32205-M）
福尔马林（Sigma-Aldrich，目录号：R04586-82）
Milteforan ® 20 mg / ml（十六烷基磷酸胆碱，[HePC]，Virbac S.A.）
刃天青钠盐（7-羟基-3H-苯恶嗪-3-一10-氧化物）（Sigma-Aldrich，目录号：R7017）
台盼蓝染料用于重要染色（BDH，目录号：34078）
氯化钾（KCl），ACS试剂，≥99.0％（Sigma-Aldrich，目录号：746336）
磷酸二氢钾（KH 2 PO 4 ），ACS试剂，≥99.0％（Sigma-Aldrich，目录号：795488）
氯化钠99.9％（NaCl）（Applichem，目录号：381659）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ），ACS试剂，≥99.0％（Sigma-Aldrich，目录号：795410）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Sigma-Aldrich，目录号：L4509）
胎牛血清（Biowest，目录号：S181B）（请参阅食谱）
完整的RPMI-1640培养基（请参阅食谱）
填写施耐德的媒体（请参阅食谱）
磷酸盐缓冲盐水，1x（PBS，pH 7.2）（请参阅食谱）
刃天青溶液（参见配方）
0.4％（w / v）台盼蓝拒染染料（请参阅配方）
0.01％w / v十二烷基硫酸钠（SDS）（请参阅食谱）
裂解液（请参阅食谱）

设备

搅拌水浴（Labtech，目录号：LSB-015S）
ELISA酶标仪（Dynatech Laboratories，目录号：MRX）
吉尔森移液器（吉尔森，型号：PIPETMAN Classic P-10，P-20，P-200，P-1000）
多通道移液器（品牌，目录号：703710）
Malassez计数室（Paul Marienfeld GmbH＆amp; Co.，目录号：0640610）
微孔板转子（Centurion Scientific Ltd，目录号：BRK 5530）
New Brunswick TM Galaxy ® 170 S CO 2 培养箱（Eppendorf，目录号：Galaxy 170 S）
冷藏离心机（Centurion Scientific Ltd，目录号：PrO-Research K241R）
光学显微镜（奥林巴斯，货号：BHB）
pH计（Thermo Fisher Scientific，目录号：13-644-928）
移液器控制器（品牌，目录号：Accu-jet ® pro 26300）
冷藏培养箱26°C（Sanyo，目录号：MIR-253）
无菌生物安全柜（Telstar，目录号：Bio-II-A）
蒸馏水机（Sartorius，目录号：H2O-I-1-UV-T）

软件

Microsoft ® Office Excel 2010（Microsoft）

程序

体外细胞培养方法对总酚类组分（TPF）抗利什曼原虫 spp的抗疟疾活性进行生物学评估。使用刃天青素还原试验测定前鞭毛体
1. 使用适当的溶剂制备已知浓度的植物提取物。 TPF溶于62.5％的纯乙醇，31.25％的无菌蒸馏水和6.25％的DMSO。
  注：使用离心分离萃取（CPE）技术从特级初榨橄榄油中回收TPF，这是一种创新的无固体载体分离技术，源自离心分离色谱（CPC）。简而言之，使用实验室规模的离心隔板萃取器FCPE300 ® 进行液-液色谱，该离心机配备了由7个堆叠隔板组成的转子圆盘上刻有总共231个分配单元，而柱子的总体积为300毫升（Koutsoni 等人，2018）。
2. 培养 L。婴儿和 L。在25 cm 2 细胞培养瓶中的主要前鞭毛体，在26°C下装有10 ml完全RPMI-1640培养基（配方2）。
  注意：利什曼原虫 spp的长期体外培养。导致毒力的逐步丧失（Segovia 等人。，1992）。随后，维护利什曼原虫 spp。通过在BALB / c小鼠中连续传代可实现毒力。在 L的情况下，将脾脏组织均质化后即可获得组织变形虫。婴儿或淋巴结 L。主要。在26°C的完全RPMI-1640培养基中培养期间，可实现胞内变形虫向感染性前鞭毛虫的转化。将寄生虫培养物传代培养到新鲜培养基中（通常在第4天，取决于传代后的 Leishmania 菌株），直到达到第10个传代培养（ Nasiri 等。，2013年）。利什曼原虫 spp的合适接种剂量。前鞭毛体通常是每毫升2 x 10 6 寄生虫。
3. 让寄生虫在26°C进入平稳生长阶段。然后使用无菌的一次性移液管轻轻移液除去前鞭毛体。
  注意：利什曼原虫病 spp。前鞭毛体通常在3-5天后进入稳定生长阶段，具体取决于利什曼原虫菌株。例如 L。主要，一种常用菌株，当达到3.5 x 10 7 寄生虫/ ml的数量时（Nasiri et al。，2013）。
4. 确定利什曼原虫 spp的数量。通过在光学显微镜下在Malassez计数室中使用锥虫蓝排除染料（配方6）对死活寄生虫进行死活活寄生虫的计数，可以测定每毫升前鞭毛体的含量。
  注意：前鞭毛虫在锥虫蓝染料中的最终稀释取决于体外寄生虫培养物的密度。通常，在体外的第3天或第4天，将前鞭毛体最终稀释度为1:20是合适的em>文化。此外，计数前，前鞭毛体必须用2％（v / v）福尔马林固定。
5. 种子1 x 10 6 L。婴儿前鞭毛体和7.4 x 10 5 L。在无菌生物安全柜中，每个菌株的每个孔中含有主要前鞭毛体，最终体积为100 µl完整RPMI-1640培养基，每个菌株分别置于96孔平底组织培养板中。
  注意：不同浓度的固定相 L。婴儿和 L。主要前鞭毛体（例如10 4 ，2.5 x 10 4 ，5 x 10 4 ，7.5 x 10 4 ，10 5 ，2.5 x 10 5 ，5 x 10 5 ，7.5 x 10 5 ，10 6 ，最终体积为200 µl /孔）通常在实验开始之前进行筛选，以确定最佳的细胞密度（Corral 等人。，2013）。
6. 一式三份添加各种浓度递增的TPF（5-400 µg / ml），并用完整的RPMI-1640培养基填充孔中，直到最终体积为每孔200 µl。
  注意：植物提取物的浓度可能因天然产物而异。
7. 以适当的50％抑制浓度（IC 50 ）一式三份添加一种参考药物（即，一种目前正在参与利什曼病化学治疗的药物）。十六烷基磷酸胆碱（HePC）的浓度为3.3 µg / ml， L的浓度为6.4 µg / ml。婴儿和 L。如前所述（Koutsoni et al。，2018）。
8. 一式三份的各种阴性对照也包括在内。更具体地说，是利什曼原虫 spp。前鞭毛体仅在完全RPMI-1640培养基和利什曼原虫 spp的存在下培养。在等体积的TPF溶剂中培养的前鞭毛体一式三份（图1）。
  注意：还包括一式四份的无寄生虫完全RPMI-1640培养基，以用作空白。
  
  图1.设计用于估算利什曼病的TPF提取物的IC 50 的示例测试板 spp。前鞭毛体
9. 用石蜡膜密封培养板，并在26°C的培养箱中以不可倒置的方式培养60 h。
10. 在每个孔中添加终浓度为20 µg / ml的刃天青溶液（配方5），并通过移液彻底混合。
11. 用石蜡膜密封板，然后在26°C的培养箱中以非反转的方式进一步孵育，直到在阴性对照组中观察到荧光红色（图2）。
  注意：刃天青是一种无毒的，可渗透细胞的化合物，响应细胞胞质溶胶中还原性环境的变化，它可以从无荧光的蓝色染料转变为高荧光的红色试卤灵（Ahmed 等。，1994； Nociari 等。，1998）。值得注意的是，潜伏期取决于各种参数，例如寄生虫菌株，范围从3到72 h不等（Mikus和Steverding，2000； Bilbao-Ramos 等人。，2012 ； Corral 等。，2013； Kyriazis 等。，2013）。
  
  图2.代表性的非荧光蓝色孔（编号1-4）和荧光红色孔（编号7-12）
12. 通过使用酶标仪在570 nm处激发和630 nm处的参考滤光片读取板。
  注意：间苯二酚的激发和发射光谱相当宽，可以使用530至570 nm之间的激发滤光片（捷克，2011年）。
通过体外刃天青素还原试验来评估导致培养的巨噬细胞产生50％细胞毒性（CC 50 ）的TPF浓度。
1. 使用适当的溶剂制备已知浓度的植物提取物。 TPF溶于62.5％的纯乙醇，31.25％的无菌蒸馏水和6.25％的DMSO。
  注意：如步骤部分所述，使用离心分配萃取（CPE）技术从特级初榨橄榄油中回收TPF，这是一种创新的无固体支持物分离技术，源自离心分离色谱（CPC）。，步骤A1。
2. 在25 cm 2 细胞培养瓶中培养J774A.1巨噬细胞，并在37°C和5％CO 2 湿润空气下，用装有10 ml完全RPMI-1640完全培养基的滤器盖。
  注意：实验中使用的J774A.1巨噬细胞可长期保存在液氮中。更具体地说，将J774A.1巨噬细胞细胞系在补充有10％DMSO的完全RPMI-1640培养基中冷冻，并储存在液氮中的适当冷冻管中。对于解冻过程，将冷冻管立即置于37°C水浴中，解冻后，将其转移至装有预热的完全生长培养基的离心管中。将细胞悬液在300 x g 离心5分钟。轻轻地将细胞重悬于完全的RPMI-1640培养基中，并转移到25°Ccm 2 带有过滤器盖的细胞培养瓶中，在37°C下5 ％的加湿空气。
3. 使巨噬细胞达到约70％汇合的高密度种群。
  注意：通常在5％CO 2 湿空气中，于37°C在RPMI-1640完全培养基中培养的J774A.1巨噬细胞，通常在3到4天内达到70％的汇合度。
4. 然后，除去大部分培养基，并在烧瓶中保留约2 ml培养基，并通过用细胞刮刀以45°角轻轻和缓慢地刮擦细胞来分离巨噬细胞单层（请参阅视频1）（参考23和29）
  
  视频1.抓取
5. 在光学显微镜下，使用Malpanz计数室中的锥虫蓝排除染料，通过对死活细胞进行差异计数来确定每毫升巨噬细胞的数量。
  注：巨噬细胞在台盼蓝染料中的最终稀释取决于培养物的密度。通常，在3 rd 或4 rth处最终稀释1:20的巨噬细胞是合适的体外培养的一天。
6. 在无菌生物安全柜下的96孔平底组织培养板中，每孔播种4 x 10 4 J774A.1巨噬细胞，最终体积为100 µl完整RPMI-1640培养基。
7. 将平板在37°C，5％CO 2 湿润空气中于非反转位置孵育18小时，以实现细胞粘附。
8. 一式三份添加各种浓度递增的TPF（5-400 µg / ml），并用完整的RPMI-1640培养基填充孔中，直到最终体积为每孔200 µl。
  注意：植物提取物的浓度可能因天然产物而异。
9. 以适当的50％抑制浓度（IC 50 ）一式三份加入一种参考药物。如前所述（Koutsoni等人，2018），十六烷基磷酸胆碱（HePC）的使用浓度为60.2μg/ ml。
10. 一式三份的各种阴性对照也包括在内。更具体地说，包括仅在完全体积为200 µl的完整RPMI-1640培养基中培养的J774A.1巨噬细胞和在等体积的TPF溶剂中培养的J774A.1巨噬细胞。
  注意：还包含一式四份的无巨噬细胞的完整RPMI-1640培养基，以用作空白。
11. 在37°C和5％CO 2 湿润空气下，将培养板在同相位置孵育72小时。
12. 在每个孔中添加终浓度为20 µg / ml的刃天青溶液，并通过移液彻底混合。
13. 在37°C的5％CO 2 湿润空气下，以非反转的方式孵育板，直到阴性对照组中观察到荧光红色。
  注意：仅在完全RPMI-1640培养基存在下培养J774A.1巨噬细胞的潜伏期，直到通常出现24小时出现红色为止。
14. 通过使用酶标仪在570 nm处激发和630 nm处的参考滤光片读取酶标板。
体外细胞培养方法对TPF提取物对细胞内 Leishmania spp的抗猪鞭毛活性的生物学评估。刃天青还原法测定氨基苯甲酸酯
1. 使用适当的溶剂制备已知浓度的植物提取物。 TPF溶于62.5％的纯乙醇，31.25％的无菌蒸馏水和6.25％的DMSO。
  注意：如步骤部分所述，采用离心分配萃取（CPE）技术从特级初榨橄榄油中回收TPF，这是一种创新的无固体载体分离技术，源自离心分离色谱（CPC），步骤A1。
2. 在25 cm 2 细胞培养瓶中培养J774A.1巨噬细胞，该培养瓶盖中装有10 ml完整RPMI-1640培养基，在37°C和5％CO 2 湿润空气下进行。
3. 使巨噬细胞达到约70％汇合的高密度种群。
  注意：通常在5％CO 2 湿空气中，于37°C在RPMI-1640完全培养基中培养的J774A.1巨噬细胞，通常在3到4天内达到70％的汇合度。
4. 然后，用无菌的一次性移液管移走大部分培养基，并在烧瓶中保留约2 ml培养基，并通过用细胞刮刀以45°角轻轻刮擦细胞来分离巨噬细胞单层（参见视频1）（参考23和29）。
5. 在光学显微镜下，使用Malpanz计数室中的锥虫蓝排除染料，通过对死活细胞进行差异计数来确定每毫升巨噬细胞的数量。
  注意：请参阅“过程”部分中步骤B5的注释。
6. 每孔中接种5 x 10 4 J774A.1巨噬细胞，在无菌生物安全柜下的96孔平底组织培养板中，将最终体积为100 µl完整RPMI-1640培养基接种。
7. ＆nbsp;在5％CO 2 湿润空气中于37°C于非反转位置孵育板18小时，以实现细胞粘附。
8. 种子7.5 x 10 5 利什曼原虫 spp。每个孔中的早期静止期前鞭毛体（即，寄生虫与巨噬细胞的比例为15：1），最终最终体积为200 µl完全RPMI-1640培养基。
  注意：为了避免感染，阴性对照也包括一式三份不含前鞭毛体的巨噬细胞。
9. 将培养板在37°C下，5％CO 2 湿润空气中以相同的方向孵育48小时。
10. 然后，通过使用45°角的多通道移液器，在37°C下预热的RPMI-1640培养基洗涤三次，除去未内在化的前鞭毛体。
11. 一式三份添加各种浓度递增的TPF（5-400 µg / ml），并用完整的RPMI-1640培养基填充孔中，直到最终体积为每孔200 µl。
  注意：植物提取物的浓度可能因天然产物而异。
12. 以适当的50％抑制浓度（IC 50 ）一式三份加入一种参考药物。十六烷基磷酸胆碱（HePC）的浓度为0.6 µg / ml， L的浓度为3.2 µg / ml。婴儿和 L。，如先前所述（Koutsoni 等人，，2018年）。
13. 一式三份的各种阴性对照也包括在内。更具体地说，仅在没有药物影响的完全RPMI-1640培养基中培养被 Leishmania 感染的J774A.1巨噬细胞和以相同体积培养的被 Leishmania 感染的J774A.1巨噬细胞包括TPF的溶剂（图3）。
  注意：还包括一式四份无寄生虫和无细胞的完整RPMI-1640培养基，以用作空白。
  
  图3.设计用于估算利什曼病的TPF提取物的IC 50 的示例测试板 spp。变形虫
14. 将培养板在37°C下，5％CO 2 湿润空气中以相同的方向孵育48小时。
15. 用多通道移液器除去培养上清液，并加入50 µl裂解液破坏巨噬细胞膜（第8条）（Bilbao-Ramos等人，2012年）。
16. 在室温下，将培养板在非反转位置孵育20分钟。
17. 将板在300 xem离心5分钟，以去除细胞裂解液。
18. 除去上清液，并以每孔200 µl的完整施耐德昆虫培养基（配方3）替换。
  注意：首选施耐德昆虫培养基，因为它比RPMI-1640培养基富含氨基酸，并且被认为是从利什曼原虫初次分离中更有效的培养基。 > spp。病变（Grekov 等。，2011年）。
19. 用石蜡膜密封培养板，然后在26°C的培养箱中以非颠倒位置进一步培养72小时，以便将有活力的变形虫转化为前鞭毛体并增殖。
20. 在每个孔中添加终浓度为60 µg / ml的刃天青溶液，并通过移液彻底混合。
21. 用石蜡膜密封板，然后在26°C的非反转位置进一步孵育，直到在阴性对照组中观察到荧光红色（约24 h）。
22. 通过使用在570 nm处激发和630 nm处的参考滤光片的吸光度酶标仪读取板。

数据分析

刃天青测定法提供了简单而快速的细胞活力测定。活细胞具有代谢活性，能够通过线粒体还原酶（非荧光染料刃天青）还原为强红色荧光染料试卤灵（Rezende et al。，2019）。荧光输出与在宽浓度范围内的活细胞数量成正比（O'Brien等人，2000）。

估计利什曼原虫 spp的50％抑制浓度（IC 50 ）的数据分析。前鞭毛体
通过线性回归分析和确定系数（R 2 ）的估计，评估了前鞭毛体密度与光密度（OD）获得值之间的相关性（Schneider et al。，2010）。
1. 计算从一式四份无寄生虫的完整RPMI-1640培养基（用作空白）中获得的OD值的平均值。
2. 从其他OD值中减去该平均值。
3. 计算每个一式三份的平均OD值。
4. 从利什曼原虫 spp一式三份获得的平均OD值。仅在完全RPMI-1640培养基（作为阴性对照）存在下培养的前鞭毛体代表100％的寄生虫存活和生长，因此抑制率为0％。
5. 基于表示100％增长的平均值，计算各种浓度的TPF的增长百分比以及相应的抑制百分比。
6. 选择所有值并插入一个散点图，该点在x轴上描述TPF浓度，在y轴上描述抑制百分比。
  注意：y轴上的值表示为0到1之间的实数。
7. 将x轴设置为对数刻度，并且最终图形必须在某个范围内近似线性。
  注意：计算IC 50 值的线性回归方法基于以下事实：计算出的抑制百分比大于0％且小于100％。该方法在整个剂量反应曲线中都假设为线性关系，这种情况很少见，因为它通常呈S型。为了将这种方法用于正确的IC 50 计算，通常必须将其与一个或两个轴的对数转换结合使用，以确保正确的IC剂量反应曲线转化为线性近似值（Nevozhay，2014年）。
8. 选择“添加趋势线”并选择“线性”趋势线选项。
  注意：趋势线的R平方值等于或接近1时最可靠。
9. 使用此图上的线性（y = ax + b）方程，对于y = 0.5值，x点等于IC 50 值（图4）。 IC 50 值以µg / ml表示。
  
  图4. IC 50 Excel中的计算
估计J774A.1巨噬细胞50％细胞毒性浓度（CC 50 ）的数据分析
结果表示为CC 50 值，该值定义为杀死未感染细胞培养物中一半细胞的化合物的浓度（Smee et al。，2017）。
1. 计算从无空巨噬细胞的完整RPMI-1640培养基（一式四份）的一式四份中获得的OD值的平均值。
2. 从其他OD值中减去该平均值。
3. 计算每个一式三份的平均OD值。
4. 从仅在存在完整RPMI-1640培养基（作为阴性对照）的情况下培养的J774A.1巨噬细胞一式三份获得的平均OD值代表了100％的巨噬细胞生长，因此抑制率为0％。
5. 基于表示100％增长的平均值，计算各种浓度的TPF的增长百分比以及相应的抑制百分比。
6. 选择所有值并插入一个散点图，该点在x轴上描述TPF浓度，在y轴上描述抑制百分比。
  注意：y轴上的值表示为0到1之间的实数。
7. 将x轴设置为对数刻度，并且最终图形必须在某个范围内近似线性。
  注意：计算CC 50 值的线性回归方法基于以下事实：计算出的抑制百分比大于0％且小于100％。该方法在整个剂量反应曲线中都假设为线性关系，这种情况很少见，因为它通常呈S型。为了将这种方法用于正确的CC 50 计算，通常必须将其与一个或两个轴的对数转换结合使用，以确保正确的CC将剂量反应曲线转化为线性近似值（Nevozhay，2014年）。
8. 选择“添加趋势线”并选择“线性”趋势线选项。
  注意：趋势线的R平方值等于或接近1时最可靠。
9. 对于此y = 0.5值，使用此图上的线性（y = ax + b）方程，x点等于CC 50 值。 CC 50 值以µg / ml表示。
估计利什曼原虫 spp的50％抑制浓度（IC 50 ）的数据分析。变形虫
1. 计算从无空白和无巨噬细胞的完整RPMI-1640完整培养基（一式四份）中获得的OD值的平均值。
2. 从其他OD值中减去该平均值。
3. 计算从无前鞭毛体的巨噬细胞一式三份获得的OD值的平均值，该巨噬细胞用作感染阴性对照。
4. 从其他OD值中减去该平均值。
5. 计算每个一式三份的平均OD值。
6. 仅在完全RPMI-1640培养基（无任何药物影响）作为阴性对照的情况下培养的，由三次被Leemmania 感染的J774A.1巨噬细胞一式三份获得的平均OD值代表100％的寄生虫存活和生长，因此抑制率为0％。
7. 基于表示100％增长的平均值，计算各种浓度的TPF的增长百分比以及相应的抑制百分比。
8. 选择所有值并插入一个散点图，该点在x轴上描述TPF浓度，在y轴上描述抑制百分比。
  注意：y轴上的值表示为0到1之间的实数。
9. 将x轴设置为对数刻度，并且最终图形必须在某个范围内近似线性。
  注意：计算IC 50 值的线性回归方法基于以下事实：计算出的抑制百分比大于0％且小于100％。该方法在整个剂量反应曲线中都假设为线性关系，这种情况很少见，因为它通常呈S型。为了将这种方法用于正确的IC 50 计算，通常必须将其与一个或两个轴的对数转换结合使用，以确保正确的IC剂量反应曲线转化为线性近似值（Nevozhay，2014年）。
10. 选择“添加趋势线”并选择“线性”趋势线选项。
  注意：趋势线的R平方值等于或接近1时最可靠。
11. 使用此图上的线性（y = ax + b）方程，对于y = 0.5值，x点等于IC 50 值。 IC 50 值以µg / ml表示。
选择性指数（SI）的确定
选择性指数（SI）定义为J774A.1巨噬细胞的50％细胞毒性浓度与利什曼原虫 spp的50％抑制浓度之比。 amastigotes（CC 50 / IC 50 ）。被测化合物对细胞内利什曼原虫 spp的体外活性。鼠类巨噬细胞缺乏对小鼠巨噬细胞的明显细胞毒性（SI> 1），表明其具有治疗利什曼病的潜力（Makwali et al。，2015）。

笔记

建议在首次进行测定之前优化实验参数，例如孵育时间，细胞和寄生虫的数量以及刃天青的用量，因为这些参数会影响代谢测定的一致性（Czekanska，2011； Kim和Jang，2018）。而且，刃天青和试卤灵对光敏感并且需要避光保护，否则会导致灵敏度降低。

菜谱

胎牛血清（FBS）
1. 解冻FBS，并在不断搅拌下在搅拌的水浴中于56°C加热灭活30分钟。
2. 储存在-20°C直到使用
完整的RPMI-1640培养基
1. 加入5 ml的L-谷氨酰胺（储备溶液200 mM，在-20°C下储存），5 ml青霉素-链霉素（储备溶液10,000 U / ml，在-20°C下储存）和5 ml HEPES（储备溶液1 M）至500 ml RPMI-1640培养基
2. 储存在4°C
3. 取适当的体积，并添加FBS至最终浓度的10％v / v
完整填写施耐德的媒体
1. 加入5 ml青霉素-链霉素（储存在10,000°C / ml的-20°C的溶液中）
2. 储存在4°C
3. 取适当的体积，将FBS添加至最终浓度的20％v / v
磷酸盐缓冲液（PBS），10x，pH = 7.2-7.4
1. 将800毫升蒸馏水放入合适的容器中，溶解80克NaCl，2克KCl，11.5克Na 2 HPO 4 和2克KH 2 PO 4
2. 搅拌直至盐完全稀释，并根据需要用NaOH（1 M）或HCl（1 M）溶液将溶液调节至所需的pH（通常为7.2-7.4）
3. 加入无菌和蒸馏水直至最终体积为1,000 ml，并通过孔径为0.22 µm的注射器过滤器单元进行灭菌
4. 通过在450 ml无菌和蒸馏水中稀释50 ml的10x储备液来制备1x的工作溶液
5. 储存在4°C
刃天青溶液
1. 将所需量的刃天青钠盐溶解在所需的PBS 1x最终体积中（例如，将2.46 mg刃天青在1 ml PBS 1x中溶解以得到中间溶液，然后每孔稀释5 µl为了达到60 µg / ml的最终浓度）
2. 在实验过程中避光
3. 每次使用前都必须新鲜配制工作浓度的刃天青溶液（捷克，2011年）
0.4％（w / v）台盼蓝拒染染料
一种。将0.4 g的锥虫蓝溶于100 ml的PBS 1x中。搅动
b。通过打褶的滤纸过滤，并通过0.22 µm孔径的注射器过滤器单元进行消毒
C。室温存放
0.01％（w / v）十二烷基硫酸钠（SDS）
一种。在100 ml蒸馏水中稀释0.01 g SDS。搅动
b。室温保存
裂解液
在RPMI-1640培养基中稀释4.8 µl HEPES（1 M储备液）和6 ml 0.01％SDS溶液，以使最终体积为10 ml

致谢

这项研究工作的一部分由希腊研究与创新基金会（HFRI）和研究与技术总秘书处（GSRT）根据HFRI博士奖学金（GA。编号6ΝΔΘ46ΨZn2Ν-ΣΣΟ）的支持。这项工作还得到了KRHPIS II（MIS 5002486）和EATRIS（MIS 5028091）的支持。
＆nbsp;该协议是根据Koutsoni等人（2018）和Kyriazis等人（2013）进行改编和修改的。

利益争夺

作者宣称他们没有竞争利益。

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