材料和试剂

1.5 ml透明微量离心管（Gunster biotech，目录号：MB-E17-A）
兔肌肉G-肌动蛋白（细胞骨架，目录号：AKL99-C）
如先前所述，重组人Dyn1和Dyn2蛋白被表达和纯化（Liu等，2011； Chin等，2015）。
蛋白质梯子（ARROWTEC，目录号：PM2500）
Tris（AppliChem，目录号：A1086）
CaCl 2 （AppliChem，目录号：A1873）
ATP（Jena Bioscience，目录号：NU-1010）
DTT（AppliChem，目录号：A2948）
氯化钾（AppliChem，目录号：A1362）
MgCl 2 （AppliChem，目录号：131396）
SDS，20％（w / v）溶液（Bio Basic Canada Inc.，目录号：SD8119）
甘氨酸（AppliChem，目录号：A1067）
甲醇（J.T. Baker，目录号：9093-68）
考马斯亮蓝R-250（AppliChem，目录号：A1092）
醋酸（AppliChem，目录号：131008）
Alexa Fluor 488鬼笔环肽（可选，Invitrogen，目录号：A12379）
蔗糖（AppliChem，目录号：131621）
甘油（AppliChem，目录号：141339）
溴酚蓝（AppliChem，目录号：A3640）
HEPES（AppliChem，目录号：A1069）
EDTA（AppliChem，目录号：A1104）
BSA（AppliChem，目录号：A1391）
甲基纤维素（Sigma-Aldrich，目录号：M0387）
液氮
葡聚糖
盐酸
葡萄糖
4个SDS-PAGE样本缓冲液（请参阅食谱）
考马斯亮蓝解决方案（请参阅食谱）
常规肌动蛋白缓冲液（请参阅食谱）
10x肌动蛋白聚合缓冲液（请参阅食谱）
成像缓冲液（可选，请参见配方）
SDS运行缓冲区（请参阅配方）
修饰缓冲区（请参见食谱）

设备

P2和P200微量移液器
-80°C冷冻室
高速微型冷冻离心机（久保田，型号：3700）
防生物危害转子（久保田，型号：AF-2724A）
配备63x 1.4-NA油浸物镜的荧光共聚焦显微镜（ZEISS，LSM 700）
电泳电源（Major Science MP-300V电源或类似电源）
SDS-PAGE电泳系统
扫描仪（EPSON Perfection V600照片）

软件

ImageJ图像处理和分析软件（美国国立卫生研究院图像， https://imagej.nih.gov/ij/ ）

程序

肌动蛋白原液的制备
1. 将冻干的G-肌动蛋白粉末在3,000 x g 的条件下于4°C短暂离心5分钟，以将粉末收集在试管底部。
2. 对于一小瓶G-肌动蛋白粉，用10μl蒸馏水将G-肌动蛋白重构为10 mg / ml，然后该蛋白将在以下缓冲液中：5 mM Tris-HCl pH 8.0，0.2 mM CaCl 2 、0.2 mM ATP，5％（w / v）蔗糖和1％（w / v）葡聚糖。等分到实验大小的储备液（例如，5μl）中后，肌动蛋白应在液氮中速冻并储存在-80°C下。
F-肌动蛋白重构
注意：演示了一个5μl肌动蛋白等分试样的以下程序。
1. 快速解冻等分的肌动蛋白，然后放在冰上。
2. 通过提供0.2 mM ATP和0.5 mM DTT制备普通肌动蛋白缓冲液，然后在冰上冷却。
  注意：ATP和DTT应该在使用前新鲜添加。
3. 在冷的常规肌动蛋白缓冲液（例如，5μlG-actin储备液和120μl常规肌动蛋白缓冲液）中稀释肌肉肌动蛋白并将其重悬至0.4 mg / ml。
  注意：通过缓慢移液轻轻混合溶液，以免产生气泡。不要涡动。
4. 在冰上孵育60分钟，使肌动蛋白低聚物解聚。
5. 在孵育过程中将离心机预冷至4°C。
6. 在4°C下以20,000 x g 的速度离心肌动蛋白溶液15分钟。
7. 分装并转移120 µl G-肌动蛋白溶液（上清液）到新的，预冷的微量离心管中，并加入12 µl新鲜制备的10x聚合缓冲液（体积的1/10）。通过移液混合均匀。
8. 在室温下孵育1小时以形成F-肌动蛋白。
F-肌动蛋白捆绑（以下步骤应在室温下完成）
1. 用蒸馏水将50 µl新鲜制备的10x肌动蛋白聚合缓冲液稀释至1x。（例如，新鲜制备的50μl10x肌动蛋白聚合缓冲液加450μl蒸馏水）。
2. 在1x肌动蛋白聚合缓冲液中将动力蛋白稀释至2μM（每个反应使用20 µl 2μM动力蛋白）。
3. 将20μl得自程序B的聚合F-肌动蛋白等分到新的微量离心管中。
4. 将来自步骤C2的20μl2μMdynamin添加到F-肌动蛋白管中，并通过移液均匀混合。反应中产生的蛋白质浓度是1x聚合缓冲液和1μMdynamin和5μMF-肌动蛋白。
  注意：作为对照，请记住仅包括一管F-肌动蛋白（例如，20 µl肌动蛋白+ 20 µl 1X聚合缓冲液）。
5. 在室温下孵育反应30分钟。
可视化F-肌动蛋白束（可选）
1. 准备成像缓冲液。
2. 用5μl成像缓冲液稀释来自步骤C5的0.5μl肌动蛋白溶液。
3. 从上述混合物中取4μl，放在载玻片上，盖上盖玻片。
4. 在共聚焦显微镜下立即检查图像以检查捆绑状态。代表性图片如图1所示。
  注意：此过程不适用于延时成像分析。
  
  图1.在Dyn2存在下F-肌动蛋白束。肌动蛋白丝用Alexa Fluor 488鬼笔环肽标记，并在共聚焦显微镜下成像。比例尺：20μm。
分析捆绑活动（跳过过程D）
1. 通过在室温下以14,000 x g 离心20分钟来沉淀F-肌动蛋白及其相关蛋白。
2. 小心地将上清液收集到新的微量离心管中，然后将沉淀物留在原来的离心管中。
3. 在1x SDS-PAGE样品缓冲液中溶解上清液和沉淀。
  注意：每个部分的最终体积应相同（例如，将40 µl上清液重悬于13 µl 4x样品缓冲液中，并将沉淀重悬于53 µl 1x样品中缓冲区）。
4. 使样品均经过SDS-PAGE处理，并通过0.2％考马斯亮蓝染色使蛋白质可视化。
5. 去除背景色后，将凝胶小心地放入两张塑料纸中，并通过扫描捕获数字图像。一个有代表性的例子如图2所示。
  
  图2. Dyn2具有显着的肌动蛋白束缚活性。 A.与动力蛋白1和2一起孵育后，肌动蛋白沉淀下来。 P：颗粒。 B.肌动蛋白的肌动蛋白束缚活性的定量结果。使用单向方差分析，随后的Dunnet事后检验分析了三个独立实验的数据。 * P ＆lt; 0.05。

数据分析

用ImageJ测量条带强度并减去背景强度。沉淀的肌动蛋白的比例被解释为在存在dynamin的情况下的F-肌动蛋白束缚活性，并被量化为总肌动蛋白强度中的沉淀级分强度[颗粒/（颗粒+上清液）]。每个反应至少应独立进行三次以进行统计定量。

菜谱

注意：对于所有食谱，请使用分子生物学级试剂。溶液应用蒸馏水配制。

常规肌动蛋白缓冲液
5 mM Tris（pH 7.4）
0.2 mM CaCl 2
0.2 mM ATP（在使用前添加）
0.5 mM DTT（在使用前添加）
10x肌动蛋白聚合缓冲液
500 mM氯化钾
20 mM氯化镁 2
10 mM ATP（在使用前添加）
成像缓冲液
10 mM HEPES（pH 7.4）
50 mM氯化钾
1毫米MgCl 2
0.1 mM EDTA
1毫米DTT
3 mg / ml葡萄糖
2mg / ml牛血清白蛋白
0.2％甲基纤维素
50μl/ ml Alexa Fluor 488鬼笔环肽
4个SDS-PAGE样本缓冲区
200 mM Tris（pH 6.8）
8％SDS
40％甘油
0.1％溴酚蓝
SDS运行缓冲区
25 mM Tris
250 mM甘氨酸
0.1％SDS
考马斯亮蓝溶液（100毫升）
45毫升甲醇
45毫升蒸馏水H 2 O
20毫升冰醋酸
0.2克考马斯亮蓝
脱色缓冲液（1 L）
500毫升蒸馏水
400毫升甲醇
100毫升乙酸

致谢

这项工作得到了科技部拨款107-3017-F-002-002和台湾大学授予NTU-CDP-106R7808的支持。该协议源自我们之前的工作（Chuang et al。，2019）。

利益争夺

作者宣称没有任何竞争的经济利益。

参考文献

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Chin，Y.H.，Lee，A.，Kan，H.W.，Laiman，J.，Chuang，M.C.，Hsieh，S.T. and Liu，Y.W.（2015）。与中心核肌病相关的Dynamin-2突变是多态性的，并导致T管破裂。哼哼传承 24（19）：5542-5554。
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