材料和试剂

50 ml聚丙烯锥形管（Nunc，目录号：339653）
微型电磁搅拌棒（科技产品，目录号：F37121-0012）
2.0 ml安全锁定微量离心管（Eppendorf，目录号：022363352）
1.7 ml微量离心管（VWR，目录号：87003-294）
MColorpHast pH试纸（pH 0-6）（Millipore Sigma，目录号：1095310001）
1毫升注射器（Becton Dickinson，目录号：309597）
Millex-GV针头过滤器单元，0.22 µm（Millipore Sigma，目录号：SLGV033R）
12 x 32 mm螺旋颈HPLC样品瓶（Waters，目录号：186000273）
瓶顶真空过滤器（VWR，目录号：10040-468）
Caulobacter crescentus 菌株NA1,000（实验室菌株，可应要求提供）
Bactopeptone（BD Biosciences，目录号：211677）
酵母提取物（BD Biosciences，目录号：212750）
七水合硫酸镁（MgSO 4 ·7H 2 O）（Fisher，目录号：BP213）
二水合氯化钙（CaCl 2 ·2H 2 O）（Fisher，目录号：BP510）
乙二胺四乙酸（EDTA）（Fisher，目录号：BP118）
七水合硫酸锌（ZnSO 4 ·7H 2 O）（Millipore Sigma，目录号：Z0251）
七水合硫酸铁（FeSO 4 ·7H 2 O）（ACROS Organics，目录号：423730050）
水合硫酸锰（MnSO 4 ·7H 2 O）（Millipore Sigma，目录号：M7634）
五水合硫酸铜（CuSO 4 ·5H 2 O）（Millipore Sigma，目录号：209918）
硝酸钴（II）六水合物（Co（NO 3 ） 2 ·6H 2 O）（Millipore Sigma，目录号：239267）
十水合四硼酸钠（Na 2 B 4 O 7 ·10H 2 O）（Millipore Sigma，目录号： B9876）
硫酸（Millipore Sigma，目录号：320501）
亚硝酸三乙酸（C 6 H 9 NO 6 ）（Millipore Sigma，目录号：N9877）
七水合七钼酸铵（NH 4 Mo 7 O 24 ）（Millipore Sigma，目录号：09878）
磷酸氢二钠（Na 2 HPO 4 ）（Fisher，目录号：BP331）
磷酸氢二钾（KH 2 PO 4 ）（Fisher，目录号：P285）
咪唑（Millipore Sigma，目录号：I2399）
葡萄糖（Fisher，货号：D16500）
谷氨酸钠（Millipore Sigma，目录号：49621）
氯化铵（NH 4 Cl）（Fisher，目录号：A661）
十二烷基硫酸钠（SDS）（Millipore Sigma，目录号：L3771）
Pronase E（VWR，目录号：VE629）
Tris base（Fisher，目录号：BP152）
氯化钠（NaCl）（Fisher，目录号：BP358）
球形双链霉菌ATCC 21553的突变溶菌素（Millipore Sigma，目录号：M9901）
磷酸（H 3 PO 4 ）（Millipore Sigma，目录号：79607）
氢氧化钠（Fisher，目录号：S318）
硼酸（H 3 BO 3 ）（Millipore Sigma，目录号：B6768）
硼氢化钠（NaBH 4 ）（Millipore Sigma，目录号：452882）
HPLC级甲醇（Millipore Sigma，目录号：34860）
叠氮化钠（NaN 3 ）（Fisher，目录号：BP9221）
蛋白ept酵母提取物（PYE）培养基（请参阅食谱）
Hutner-咪唑-葡萄糖-谷氨酸（HIGG）生长培养基（请参见食谱）
浓缩的哈特纳碱（每1升）（请参阅食谱）
0.5 M磷酸盐缓冲液，pH 7.0（请参见配方）
HIGG媒体（请参阅食谱）
Pronase E缓冲区（请参阅食谱）
50 mM磷酸盐缓冲液（pH 4.9）（请参阅食谱）
500 mM硼酸盐缓冲液（pH 9）（请参阅食谱）
HPLC缓冲液A（请参阅配方）
HPLC缓冲液B（请参见食谱）

设备

ELGA PURELAB Flex 3净水系统（ELGA LabWater）
磁性热板搅拌器（Thermo Scientific，目录号：SP195025）
Sorvall Lynx 6000离心机（Thermo Scientific）
50 ml锥形离心管转子（Thermo Scientific，目录号：Fiberlite F14-14x50cy）
pH计（Fisher，目录号：13-636-AB150）
Sorvall WX 80+超速离心机（Thermo Scientific，目录号：75000080）
摆动铲斗转子TH-641（Thermo Scientific，目录号：54295）
用于TH-641转子的14 x 89毫米厚壁聚碳酸酯管（Seton Scientific 2013）
定角转子T-1270（Thermo Scientific，目录号：08259）
用于T-1270转子的16 x 76毫米厚壁聚碳酸酯管（Seton Scientific 2004）
数字干浴器（Fisher，目录号：88-871-001）
6 x 1.5 ml的干浴块（Fisher，目录号：88-871-103）
6 x 2.0 ml的干浴块（Fisher，目录号：88-871-104）
微量离心机（Eppendorf，型号：5424）
玻璃培养管（13 x 100 mm）（Fisher，目录号：14-961-27）
微型刮刀（Fisher，目录号：S50823）
Vortexer（Fisher，目录号：02-215-414）
Agilent 1260 Infinity II HPLC系统，包括：
1. Agilent 1260 Infinity II四元泵
2. Agilent 1260 Infinity II多功能进样器
3. Agilent 1260 Infinity II多柱温箱
4. Agilent 1260 Infinity II二极管阵列检测器（DAD）
5. Agilent 1260 Infinity II四元泵
6. Agilent 1260 Infinity II分析级馏分收集器
Hypersil ODS C18 HPLC色谱柱（3 µm颗粒，直径4.6 mm，长度250 mm）（Thermo Scientific，目录号：30103-254630）
Uniguard防护墨盒支架（Thermo Scientific，目录号：850-00）
Hypersil ODS C18保护盒（3 µm颗粒，直径4 mm，长度10 mm）（Thermo Scientific，目录号：30103-014001）
真空浓缩器（Eppendorf，型号：022820109）

软件

Matlab R2018b（Mathworks）
Chromanalysis v。1.0（Desmarais et al 。，2015）

程序

该程序很大程度上基于先前描述的协议（Glauner，1988； Desmarais等，2014）。我们提供了通过HPLC分离多肽的其他详细信息，以及使用柱清洁和重新平衡步骤运行连续样品的方法。

细菌培养物的接种和生长
1. 从琼脂平板或直接从冷冻培养物中的单个菌落接种2.5 ml PYE培养基，并在200 rpm摇动下于30°C过夜生长。
2. 第二天，将培养物反稀释到500 ml HIGG培养基（含有所需的磷酸盐浓度）中。在200 rpm摇动下于30°C孵育48 h。
巯肽纯化
第1天–细胞裂解
1. 在设置为450°C的搅拌器热板上的玻璃烧杯中将700 ml水烧开。对于每种要处理的培养物，准备一个装有6 ml 6％（w / v）SDS的50 ml锥形管和一个微型搅拌棒，将其放入沸水中，然后打开磁力搅拌器至300 rpm（图1）。
  
  图1.细胞裂解。将4％SDS中的细胞在搅拌下煮沸3小时。箭头指示微量搅拌棒。
2. 48小时后，以12,000 x g 离心10分钟（4°C），收获细胞。倒出上清液。饥饿的细胞非常活跃，一些沉淀会滑走。
3. 将沉淀重悬于3 ml HIGG介质中，并迅速转移至预热的50 ml锥形管中，以使最终浓度为4％SDS（w / v）。
4. 在连续搅拌下将样品煮沸3小时，必要时定期向烧杯中加水。不要太早加热，因为此步骤对于完全细胞裂解以及使细胞壁改变酶失活至关重要。 3小时后，关闭电源并继续将裂解的培养物搅拌过夜。
第2天–酶消化
1. 检查SDS是否在一夜之间沉淀；如果是这样，将样品煮沸一小时以重新溶解SDS。通过在TH-641转子中以276,000 x g 离心1 h收集球囊。在20°C旋转以避免SDS沉淀。将沉淀物重悬于6.5 ml超纯水中，然后在T-1270转子中以329,738 xem 的速度将样品离心30分钟（20°C）。
2. 重复洗涤两次。如果样品中仍然出现气泡，请额外清洗以完全去除SDS（图2）。
  
  图2.去除SDS。用超纯水洗涤的样品应该是透明的（左管），并且由于多次洗涤而失去了肥皂泡沫的外观（右管）。
3. 在10 mM Tris-HCl（pH 7.2）+ 0.06％w / v NaCl中制备1 mg / ml PronaseE。通过在加热块中将储备溶液在60°C加热至少30分钟来激活Pronase E（图3）。
  
  图3.酶切消化。用Pronase E消化细胞被膜，以消除连接外膜和肽聚糖的脂蛋白。完整的囊被消化成沿聚糖骨架切割的多肽片段。
4. 将每个样品沉淀重悬于900μl的10 mM Tris-HCl（pH 7.2）+ 0.06％w / v NaCl中，并转移到安全锁定的微量离心管中。在试管中加入100 µl激活的Pronase E，并在60°C的加热块上孵育至少2 h。 Pronase E是一种蛋白酶，可消化与肽聚糖相关的脂蛋白。
5. 向消化后的样品中加入200 µl的6％SDS（w / v），并在100°C的干浴中煮沸30分钟以停止蛋白水解。
6. 在6.5 ml超纯水中重悬液，并在T-1270转子中以329,738 x g 离心30分钟（20°C）以冲洗SDS。如前所述重复清洗两次（或尽可能长的时间以消除气泡）。
7. 在50 mM磷酸盐缓冲液（pH 4.9）中制备1 mg / ml变溶素储备液，将40-50 µl等分试样放入微量离心管中，并将其储存在-20°C下。
8. 最后一次洗涤后，将肽聚糖沉淀重悬于75-200 µl的50 mM磷酸钠缓冲液（pH 4.9）中，并将样品转移至1.7 ml微量离心管中。该体积将取决于样品中有多少肽聚糖材料。例如，来自500 ml C的葡萄球菌。将OD660为0.8-1.0的新月体培养物重悬于200μl中。向样品中添加变溶菌素至终浓度为40 µg / ml，并在37°C的干浴中消化过夜（至少10 h）。
第3天– HPLC样品制备
1. 通过将样品在100°C的干浴中煮沸5分钟来灭活muramidase。
2. 在室温下以16,000 x g 离心10分钟以除去未消化的物质。小心地将上清液转移到13 x 100 mm的玻璃管中，不要干扰沉淀。
3. 向上清液中加入500 mM硼酸盐缓冲液（pH 9），使其终浓度为100 mM。
4. 在每个样品中添加大约一半的微刮擦量（〜6 mg）硼氢化钠（图4）。应立即看到剧烈的鼓泡，然后小气泡将继续在溶液中上升。在室温下至少减少30分钟的多肽。轻轻涡旋试管，以确保硼氢化钠完全混合。
  警告：如果添加过多的硼氢化钠，则会在pH滴定过程中沉淀，这会破坏多肽的纯化。
  
  图4.用硼氢化钠还原多肽。将约0.6 mg的硼氢化钠（半微量样品）添加到样品中以减少多肽。
5. 将还原的多肽酸化至pH 3.0-4.0（多肽的等电点约为3.5）。首先加入15 µl 50％磷酸（会看到剧烈的鼓泡），然后轻轻涡旋离心管以确保充分混合。通过将1微升样品滴到pH指示纸上来测试pH。继续以5 µl的增量添加磷酸，直到pH为5.5-6.0（通常添加1-2）。继续以1 µl的增量添加磷酸，直到pH达到3.0至4.0。
HPLC设置和样品分析
1. 在将流体引导到废液容器中时，用超纯水冲洗安捷伦HPLC系统的所有4条泵管线至少10分钟。关闭废液阀，并用超纯水冲洗另外10分钟，以清洗内部管道。
2. 将泵A与溶剂A（配方9）连接，将泵B与溶剂B（配方9）连接，将泵C与HPLC级甲醇连接，将泵D与超纯水连接。在将流体引导至废液容器时，请用各自的溶剂冲洗每条管线。
3. 将柱温箱的温度设置为55°C。关闭废液阀，并将D线（100％超纯水）的流量设置为0.5 ml / min。
4. 首先连接装有保护柱的Uniguard色谱柱，以准备HPLC色谱柱。首先让5-6滴水进入色谱柱的上游端，将色谱柱连接到HPLC系统。牢固地拧紧上游连接器，等待水从下游端滴下，然后再连接色谱柱的另一端。
5. 用超纯水洗涤色谱柱20分钟，并确保色谱柱压力不超过150 bar。设置DAD检测器以收集205 nm的吸光度。
6. 用0.5毫升/分钟的溶剂A平衡色谱柱50分钟。在此步骤中，柱压和紫外线吸收率将稳定。
7. 如下制备HPLC样品。将100 µl插入样品放入干净的HPLC小瓶中，然后将50-90 µl样品添加到插入样品中。用超纯水准备2个小瓶，这些小瓶将用于冲洗系统和清理过程。将小瓶放在自动进样器单元中。
8. 如果收集峰以通过质谱进一步分析，请启用基于时间的馏分收集以收集所需的峰。根据收集的峰数在馏分收集器中放置适当数量的收集管。每个管将收集大约100-450 µl的样品，具体取决于馏分收集窗口的持续时间（10-50 s）。由于每次运行的洗脱时间可能略有不同，因此我们建议在预期的洗脱时间之前和之后收集额外的馏分，以确保所需峰的恢复。
9. HPLC方法包括从100％溶剂A到100％溶剂B的135分钟线性梯度（0.5 ml / min）。要重新平衡样品之间的色谱柱，请继续使100％溶剂B（0.5 ml / min）流动5 30分钟，然后线性梯度洗脱25分钟到100％溶剂A，最后再添加25分钟100％溶剂A。在该洗涤方案结束时，应使205 nm处的压力和吸光度稳定。
10. 在运行多肽样品之前，将50 µl超纯水注入HPLC系统中，作为背景扣除的空白。对于多肽样品，进样40-80 µl。确保注入的样品量不超过样品的总体积，以确保不会在HPLC系统中引入气泡。
11. 最后一个样品完成后，通过注入20 µl超纯水并运行以下洗涤方法来洗涤系统和色谱柱。首先用100％水（0.2 ml / min）冲洗30分钟，然后线性梯度洗脱10分钟至100％甲醇。用100％甲醇洗涤60分钟，然后用10分钟线性梯度洗脱至10％甲醇/ 90％水。再用10％甲醇/ 90％水冲洗色谱柱10分钟，然后取出色谱柱进行保存。
12. 如果收集到馏分，则合并包含目标峰的馏分，并使用真空浓缩器除去溶剂。将排气模式设置为“水性”，然后在真空浓缩器中旋转样品直至干燥，通常在30°C下干燥30-60分钟。在试管底部可以看到一小块半透明的白色沉淀。这些样品适用于LC / MS分析。
13. 可以使用基于Matlab的 Chromanalysis 软件（如先前所述（Desmarais et al 。，2015））对HPLC痕量进行定量。

数据分析

上面的协议可用于比较在不同营养环境中生长的细菌的多肽组成。对于 C。新月，磷酸盐饥饿导致LD-转肽作用增加（图5）。

图5.在不同磷酸盐浓度下生长的新月形衣原体的肽段分析。从在HIGG培养基中生长有1 mM或1 µM磷酸盐的 Caulobacter crescentus 纯化肽段并进行分析通过HPLC。箭头表示在1 µM磷酸盐色谱图中唯一存在的峰。根据先前对C的分析，对主要峰进行标记。新月形多肽（Takacs等人，2010年）。 LD交联是基于先前对 E的分析标记的。大肠杆菌多肽（Glauner，1988年），并通过LC / MS确认。此图经约翰·威利父子（John Wiley and Sons）许可转载（Stankeviciute et al 。，2019）

笔记

根据您的特定仪器，操作HPLC系统的协议可能会有所不同。有关HPLC操作的概述，我们建议使用JoVE科学教育数据库（ https://www.jove.com/science-education/10156/high-performance-liquid-chromatography-hplc ）。
在进行峰定量之前，请使用空白运行（水样）进行背景扣除。

菜谱

蛋白ept酵母提取物（PYE）培养基（1 L）
2.0克蛋白<< br /> 1.0克酵母提取物
1 mM MgSO 4
0.5 mM氯化钙 2
Hutner-咪唑-葡萄糖-谷氨酸（HIGG）培养基（Poindexter，1978）
该媒体需要几种库存解决方案：
1. 金属“ 44”（每100毫升）
  1.3毫升0.5 M EDTA二钠
  1,095.0毫克ZnSO 4 ·7H 2 O
  500.0毫克FeSO 4 ·7H 2 O
  154.0 mg MnSO 4 ·H 2 O
  39.2毫克CuSO 4 ·5H 2 O
  24.8毫克Co（NO 3 ） 2 ·6H 2 O
  17.7毫克Na 2 B 4 O 7 ·10H 2 O
  用蒸馏水将体积调至100 ml
  加入2-3滴硫酸以防止沉淀
2. 哈特纳浓缩碱（每1升）
  10.0克亚硝酸三乙酸
  29.59 g MgSO 4 ·7H 2 O
  3.335克CaCl 2 ·2H 2 O
  9.25 mg（NH 4 ） 6 Mo 7 O 24 ·4H 2 O
  99.0毫克FeSO 4 ·7H 2 O
  50.0 ml金属“ 44”
  蒸馏水至1,000毫升
  1. 加入所有试剂之前，先溶解次氮基三乙酸，然后用KOH中和；大约需要5.6克KOH＆nbsp;
  2. 在调整体积之前，添加其余的组分并将pH值调整为6.6-6.8。
  3. 用蒸馏水将溶液调至1,000毫升
  4. 通过过滤灭菌溶液（请勿高压灭菌）
3. 0.5 M磷酸盐缓冲液，pH 7.0
  将61 ml 0.5 M Na 2 HPO 4 与39 ml 0.5 M KH 2 PO 4 混合并灭菌通过高压灭菌
4. 1 M咪唑，pH 7.0（高压灭菌）
5. 20％（w / v）葡萄糖（无菌过滤）
6. 20％（w / v）的谷氨酸钠（无菌过滤）
7. 50 mM CaCl 2 （高压灭菌）
8. 1 M NH 4 Cl（高压灭菌）
要准备HIGG介质，请对所需量的蒸馏水进行高压灭菌，然后将以下组分添加到所列的最终浓度中：
5 mM咪唑，pH 7.0
2％（v / v）哈特纳的基地
1 mM CaCl 2
0.15％（w / v）葡萄糖
0.15％（w / v）谷氨酸钠
8.9 mM NH 4 Cl
1μM-1,000μM磷酸盐
Pronase E缓冲液
10 mM Tris，pH 7.2
0.06％（w / v）氯化钠
50 mM磷酸盐缓冲液，pH 4.9（100 ml）
1. 将0.2 g NaOH溶解在约90 ml水中
2. 用磷酸将溶液的pH调节至4.9
3. 用水使总体积达到100毫升
500 mM硼酸盐缓冲液，pH 9（500 ml）
1. 将15.46克硼酸溶解在约480毫升水中
2. 用NaOH将pH调节至9.0
3. 用水使总体积达到500毫升
HPLC缓冲液
缓冲液A ：50 mM NaPO 4 pH 4.35，0.4％NaN 3
1. 将2.0 g NaOH溶解在950 ml超纯水中
2. 用磷酸调节pH至4.35
3. 加入200 µl 2％（w / v）NaN 3
4. 用超纯水使总体积达到1,000毫升
5. 重新调节pH至4.35
6. 使用前无菌过滤器
缓冲液B： 75 mM NaPO 4 pH 4.95，15％甲醇
1. 将3.0 g NaOH溶解在约800 ml超纯水中
2. 用磷酸将pH调节至4.95
3. 用超纯水使总体积达到850 ml
4. 加入150 ml HPLC级甲醇
5. 重新调节pH至4.95
6. 使用前无菌过滤器

致谢

我们感谢Amanda Miguel和K.C. Huang（斯坦福大学）指导他们进行多肽纯化。我们通常已针对基于UPLC的分离（Desmarais等人，2014年）对他们的协议进行了调整，以用于HPLC系统。这项工作得到了美国国家科学基金会（MCB-1553004）对E.A.K.的资助。

利益争夺

作者没有竞争利益要声明。

参考文献

Clarke，T.B.和Weiser，J.N.（2011）。细胞外细菌的细胞内传感器。免疫学研究 243（ 1）：9-25。
de Pedro，M.A.和Cava，F.（2015）。细菌细胞壁结构的结构限制和动力学。 Front Microbiol 6：449。
Desmarais，S.M.，Cava，F.，de Pedro，M.A.和Huang，K.C.（2014）。细菌壁的分离和制备，用于通过超高效液相色谱进行成分分析。 J Vis Exp 83：e51183。
Desmarais，S.M.，Tropini，C.，Miguel，A.，Cava，F.，Monds，R.D.，de Pedro，M.A. and Huang，K.C.（2015）。使用高效液相色谱法对细菌形态发生进行高通量，高灵敏度的分析。 J Biol Chem 290（52）：31090-100。
Glauner，B.（1988年）。使用高效液相色谱法对多肽进行分离和定量。 Anal Biochem 172（2）：451-64。
Levefaudes，M.，Patin，D.，de Sousa-d'Auria，C.，Chami，M.，Blanot，D.，Herve，M.，Arthur，M.，Houssin，C.和Mengin-Lecreulx，D （2015）。棒状杆菌中的二氨基庚二酸酰胺化：LtsA在肽聚糖修饰中的作用的新见解。 J Biol Chem 290（21）：13079-94。
Mesnage，S.，Dellarole，M.，Baxter，NJ，Rouget，JB，Dimitrov，JD，Wang，N.，Fujimoto，Y.，Hounslow，AM，Lacroix-Desmazes，S.，Fukase，K.，Foster， SJ和威廉姆森，国会议员（2014）。 LysM结构域识别细菌肽聚糖的分子基础。 Nat Commun 5：4269。
Poindexter，J.S。（1978）。 Caulobacter crescentus 的非浮力形态突变体的选择。 J Bacteriol 135（3）：1141-5。
Royet，J.，Gupta，D.和Dziarski，R.（2011年）。肽聚糖识别蛋白：微生物组和炎症的调节剂。 Nat Rev Immunol 11（12）：837-51。
Schleifer，K. H.和Kandler，O.（1972）。肽聚糖类型的细菌细胞壁及其分类学意义。 Bacteriol Rev 36（4）：407-77。
Schoonmaker，M.K.，Bishai，W.R.和Lamichhane，G.（2014）。结核分枝杆菌的非经典转肽酶会改变细胞大小，形态，胞质基质，蛋白质定位，毒力和对β-内酰胺的抗性。 J细菌 196（7）：1394-402。
Stankeviciute，G.，Miguel，A.V.，Radkov，A.，Chou，S.，Huang，K.C.和Klein，E.A.（2019）。不同的交联方式在新月形杆菌中建立了肽聚糖在空间上不同的区域。 Mol Microbiol 111（4）：995-1008。
塔卡奇（Takacs，C. N.），波焦（S.）Poggio，S.，查本（Charbon），M. MreB通过细胞重塑驱动 Caulobacter crescentus 中的新生杆形态发生 J细菌 192（6）：1671-84。
Tocheva，E.I.，Lopez-Garrido，J.，Hughes，H.V.，Fredlund，J.，Kuru，E.，Vannieuwenhze，M.S.，Brun，Y.V.，Pogliano，K.和Jensen，G.J.（2013）。枯草芽孢杆菌孢子形成过程中的肽聚糖转化。分子微生物 88 （4）：673-86。
Vollmer，W。（2008）。细菌肽聚糖聚糖链中的结构变异。 FEMS Microbiol Rev 32（2）：287-306。