材料和试剂

用于无菌工作的培养罩
解剖剪刀（可以使用任何可用的解剖剪刀）
镊子-2对（最好是任何制造商的钝镊子）
冰盒
经组织培养处理的T75烧瓶（Corning，目录号：S430641）
0.22μm无菌注射器过滤器（Millex / Millipore Sigma，目录号：SLGP033RS）
10毫升注射器（BD Plastipak，货号：302188）
30毫升通用容器（Thermo Fisher Scientific，目录号：12511299）
27 G针，一次性½′（BD，货号：305109）
Nybolt筛网或70 µm细胞过滤器（猎鹰，目录号：352350）
15毫升试管（Sarstedt 62.554.502）
50 ml管（Sarstedt 62.548.004）
一次性5毫升和10毫升移液器
100 mm x 20 mm（D x H）经过组织培养的培养皿（Corning，目录号：430167）
Taqman探针，用于来自Applied Biosystems的 Acta2 （Mm00725412_s1）和 Rn18s （Mm03928990_g1），用于在图4中进行验证
4 x老鼠
DNase 1，二级，来自牛胰腺（Roche，目录号：10104159001）
胶原酶B（罗氏（Roche），目录号：11088807001）
产灰链霉菌的蛋白酶（Pronase）（西格玛，目录号：P5147）
汉克斯平衡盐溶液（Sigma-Aldrich，目录号：H9394）
轴屏蔽密度梯度介质OptiPrep TM （Abbott Diagnostics Technologies AS，目录号：1141452）
具有高葡萄糖，丙酮酸的Dulbecco改良型Eagle培养基（DMEM）（Thermo Fisher Scientific，目录号：41966）
胎牛血清（FBS）（Gibco，目录号：10500064）
青霉素-链霉素（Thermo Fisher Scientific，目录号：15140122）
L-谷氨酰胺（Thermo Fisher Scientific，目录号：25030081）
胰蛋白酶0.25％EDTA（Gibco，目录号：25200056）
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（PBS）（Sigma-Aldrich，目录号：D8537）
红细胞裂解液Hybri-Max（Sigma，目录号：R7757）
乙醇绝对值> 99.8％（VWR，20821.330P）
酶（请参阅食谱）
完整的DMEM（请参阅食谱）

设备

毫克平衡
用于小鼠窒息的CO 2 室（可以使用任何获得动物伦理委员会和动物设施批准的设备。）
摇床或水浴箱（格兰特W28）
适用于15和50毫升试管的冷冻离心机（Eppendorf，型号：5810R）
倒置显微镜（Zeiss Primovert）
用于培养细胞的培养箱（Wolflabs，Binder CB160）

程序

汇集4只小鼠的肝脏，以建立HSC分离和培养。
根据您的机构动物护理和使用委员会（IACUC）协议中批准的方法，一次安乐死1-2只小鼠。
确认死亡后，从腹部到胸腔沿中线切开小鼠皮肤。切开隔膜，有效暴露内脏器官（图1A和1B）。
轻轻地将隔膜切开处的肝叶移开，然后将肠子移至右侧以暴露下腔静脉（图1C）。

图1.小鼠肝脏灌注的逐步描绘。 A.放置鼠标进行解剖。 B.暴露内脏器官并切开隔膜。 C.轻轻将肠移至右侧。 D.通过肝门静脉注射1x HBSS。 E.切开下腔静脉（IVC）。 F.用1x HBSS洗涤。 G.卸下胆囊。 H.解剖肝脏。
用冰冷的HBSS填充10 ml注射器，然后使用27G针将这种HBSS注射入肝门静脉以灌注肝脏（图1D）。
一旦您开始通过门静脉用HBSS清洗，立即切断下腔静脉（IVC）以释放压力（图1E和1F）。
至少使用10毫升HBSS清洗每个肝脏。
注意：一次对1-2只小鼠实施安乐死有助于保持组织的完整性，并有效冲洗肝脏，从而制备更清洁的HSC。
在肝叶之间轻轻切开胆囊，注意避免刺破胆囊（图1G）。
在装有10毫升冰冷HBSS的30毫升通用容器中收集肝叶（图1H）。
进行酶消化。

视频1.小鼠肝脏灌注。该视频是根据OHSU机构动物护理和使用委员会（IACUC）协议指南，在俄勒冈州波特兰的健康科学大学（OHSU）制作的，并由比较医学部批准。

在无菌的培养罩下，从含有肝脏的通用容器中排出HBSS。
使用无菌剪刀和镊子（用70％乙醇喷洒）在同一30毫升通用容器中切碎肝脏，然后向切碎的肝脏中加入10毫升胶原酶B和10毫升Pronase。
注意：在37°C水浴中将胶原酶B和Pronase预热15分钟。
加入2 ml DNase 1溶液以防止细胞结块。
将试管倒置3-4次，将内容物充分混合，然后将通用管放入37°C的恒温振荡器中20分钟。
将消化液倒入70μm细胞过滤器中，收集到50 ml管中。使用10毫升注射器柱塞的扁平侧轻轻按压并迫使肝脏消化物从细胞过滤器中进入50毫升试管中，并用冷HBSS加满以停止酶促反应。
在室温下以600 x g 的速度离心（台式离心机约为1800 rpm）离心7分钟。
将离心机预冷至4°C，以进行密度梯度步骤。

对于梯度的最底层，将3.2 ml Optiprep添加到4.8 ml HBSS中。将8毫升分成两个15毫升试管。
对于中间阶段，通过轻轻敲打底部的50 ml管，匀浆来自步骤B6的细胞沉淀，并添加HBSS，使总体积为8.9 ml。
将5.9 ml Optiprep添加到重悬于HBSS的8.9 ml细胞沉淀中。使用10毫升移液器混合。
使用5 ml移液器，使用移液器辅助装置上的最慢设置，在每15 ml试管中的4 ml底部相的顶部轻轻逐滴添加等体积。合并两个相，每个15毫升试管中的体积应在10.5-11毫升左右。
最后，对于顶部相，在中间相中轻轻添加0.5 ml HBSS。
将两个15 ml试管以1,400 x g （约2,500 rpm）的转速在4°C下离心20分钟，不间断且缓慢加速。

图2.离心前后的密度梯度。描述离心之前（左）和离心之后（右）的各层。分离的周细胞定位在顶层HBSS与包含被HBSS和Optiprep均质化的细胞沉淀的中间层之间的相处。

HSC位于顶部的第二层中，位于HBSS之下，并显示为白色的粗带。
使用1 ml微量移液器从每个15 ml试管中轻轻取出约0.5至1 ml的该层，然后放入新的50 ml管中。点击并混合细胞，并加入2 ml DNase。往HBSS中加满50 ml，然后在室温下以600 x g 旋转7分钟。
吸出上清液并混合沉淀。加入3 ml RBC裂解缓冲液，并在37°C下孵育4-5分钟。
加入2 ml DNase溶液以防止细胞结块。用HBSS洗涤，然后以600 x g 旋转7分钟。
吸出HBSS，混合沉淀物并重悬于约10 ml预热的完整DMEM中（请参见食谱）。
最好在100 mm平板或T75烧瓶中平板接种10 ml细胞悬液。隔离后，准备工作看起来很混乱。
在5％CO 2 环境中于37°C孵育。
24小时后，轻轻旋转手掌中的盘子以移开厚厚的粘性层。为了获得澄清的制剂，吸出培养基并用3 ml温暖的PBS洗涤3-4次。重悬于完整的DMEM或进行胰蛋白酶消化以建立新的实验。

图3.分离后24 h的HSC的代表性图像。用温PBS洗涤在100 mm平板中培养的分离的HSC，并在Zeiss primovert上以10倍放大倍率成像。蓝色箭头表示已粘附的HSC。比例尺= 200 µm。
通过这种方法可以获得大约2-2.5 x 10 5 个HSC。

首次洗涤后早期阶段，HSC的胰蛋白酶消化是一个微妙的过程。用预热的PBS洗涤3次后，加入3 ml胰蛋白酶并在37°C下孵育4分钟，并在孵育过程中上下吸移约5次。
用冰冷的HBSS停止反应，并以600 x g 的转速旋转7分钟以计数细胞并重新铺板。
对于以后的胰蛋白酶消化，孵育5-6分钟，然后以类似方式进行。

让使用optiprep方法分离的HSC粘附过夜。 24小时后，用流式细胞仪洗涤，胰蛋白酶消化并分析细胞（图4）。由于 Pdgfrb 是HSC的显着标志物（Henderson等，2013），我们使用了 Pdgfrb -BAC-eGFP报告基因小鼠来验证Pdgfrb -eGFP表达细胞与从WT C57BL / 6小鼠分离的细胞一起用作阴性对照。

图4.分离的周细胞的流式细胞术。 WT C57BL / 6小鼠的HSC在BD LSRII流式细胞仪上采集了Pdgfrb-BAC-eGFP小鼠，并使用FlowJo软件版本10进行了分析。 >
为了进一步验证HSC的分化，我们将分离的细胞在完整的DMEM中培养了5天，并间歇地收集样品以分析 Acta2 基因表达（图5）。 Alpha平滑肌肌动蛋白（ Acta2 ）是HSC分化的可靠标志。

图5。HSC培养物分化后Acta2表达增加。分离并在完整DMEM中培养5天的HSC中平滑肌肌动蛋白（ Acta2 ）的mRNA水平通过分析实时定量PCR

笔记

为了获得高产量的HSC，请使用旧小鼠进行隔离或禁食过夜的小鼠。

菜谱

酶
DNase 1：在10 ml HBSS中为0.025％
胶原酶B溶液：在10毫升HBSS中为0.2％
链霉蛋白酶（来自灰色链霉菌的蛋白酶）：在10 ml HBSS中为1％
注意：使用10 ml注射器和0.22μM过滤器将所有酶溶液过滤到新的无菌通用管中。
完整的DMEM（用于文化）
20％FBS
1％青霉素-链霉素
1％L-谷氨酰胺

致谢

感谢Neil Henderson教授提供的 Pdgfrb -BAC-eGFP小鼠。这项工作得到了欧盟拨款CIG-631413（“ EGF-R for Immunity”）和医学研究理事会（MR / M011755 / 1）的支持。该协议已从Graham，2002中进行了修改。

伦理

动物实验已获得爱丁堡大学动物福利与道德审查机构的批准，并根据英国政府内政部授予的项目许可证PPL70 / 8470进行。
＆nbsp;在金·桑德斯（Kim Saunders）博士和阿努普里亚·阿加瓦尔（Anupriya Agarwal）博士的大力支持下，在俄勒冈州健康与科学大学-机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准下，进行了小鼠解剖的成像和摄像。

参考文献

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亨德森（Henderson），北卡罗来纳州（Arnold），TD，卡塔穆拉（Katamura），Y。 MJ，Maher，JJ，Iredale，JP，Lacy-Hulbert，A.，Adams，RH和Sheppard，D.（2013年）。针对α整联蛋白的目标识别了一种调控多个器官纤维化的核心分子途径。 Nat Med 19（12）：1617-1624。
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Minutti，CM，Modak，RV，Macdonald，F.，Li，F.，Smyth，DJ，Dorward，DA，Blair，N.，Husovsky，C.，Muir，A.，Giampazolias，E.，Dobie，R. ，Maizels，RM，Kendall，TJ，Griggs，DW，Kopf，M.，Henderson，NC和Zaiss，DM（2019）。巨噬细胞-周细胞轴通过双调蛋白诱导的转化生长因子β活化来指导组织修复。免疫力 50（3）：645-654 e646。