材料和试剂

高压灭菌镊子
我们更喜欢较小的镊子（大约10厘米长），其镊子的尖端平坦或呈锯齿状
P200微量移液器
显微镜载玻片
我们更喜欢预先清洁的磨砂载玻片（例如，Fisher Scientific，目录号：12-550-143）
＃1.5或1.5H厚的盖玻片
我们使用18 x 18毫米见方的盖玻片（Zeiss，474030-9000-000）
1 ml无菌注射器和两个兼容的30号无菌针头（例如，BD，目录号分别为309628和305128）
1.5 ml和2.0 ml体积的聚丙烯试管（美国科学公司，目录号分别为1615-5500和1620-2700）
木制牙签，高压灭菌
C。新甲虫和 C。加蒂物种复杂菌株
NaCl（Fisher Scientific，目录号：S271-3）
KCl（Fisher Scientific，目录号：P217-3）
Na 2 HPO 4 （Fisher Scientific，目录号：S374-500）
KH 2 PO 4 （Fisher Scientific，目录号：P-285）
盐酸（Fisher Scientific，目录号：A144-212）
Percoll ®（GE生命科学，目录号：17089102），在2-8°C下储存，保质期为两年
3-（N-Morpholino）丙烷磺酸-MOPS（Sigma-Aldrich，目录号：M3183）
蛋白ept（BD，货号：211677）
葡萄糖（BD，目录号：238230）或葡萄糖（Sigma，目录号：G7021）
酵母抽提物
琼脂（BD，货号：242720）
氨苄青霉素（Sigma-Aldrich，目录号：A5354）
Percoll ® / Sab-MOPS悬浮液（请参见食谱）
YPD肉汤和琼脂（请参见食谱）
Sabouraud葡萄糖肉汤（请参阅食谱）
磷酸盐缓冲盐水（请参阅食谱）
氨苄西林溶液（100 mg / ml）（请参阅食谱）

设备

用于DIC显微镜的显微镜
我们使用Zeiss AxioObserver Z1温控倒置显微镜（Carl Zeiss GmbH），该显微镜配有63x NA 1.4油浸物镜，DIC偏光镜和棱镜，电动载物台和聚焦镜以及冷却的单色CCD相机
用于活细胞成像的培养室
我们在封闭培养模式下使用POCmini-2细胞培养系统（PeCon GmbH）（图2）
带有定角转子的微量离心机，适合1.5-2.0 ml试管
轨道振动培养箱
我们通常使用轨道在25到28毫米之间的加热孵育摇床，但是大多数用于微生物培养的摇床都可以工作
血细胞计数器
生物安全柜
高压灭菌器

图2. POCmini-2腔室的组装。 A.从左到右的单独组件：POCmini2系统专用螺丝刀；拧紧垫片；垫片金属框架，顶部有170μm玻璃盖玻片。 B.用盖上的镊子将玻璃盖玻片安装到框架中，并在它们之间有垫片。 C.拧紧部分安装在框架中的垫圈。可以像这样对系统进行高压灭菌。 D.螺丝刀就位，将拧紧的垫圈拧紧到盖玻片上。 E.安装的系统，其注射器和针头在相对的孔上，用于注入细胞悬浮液，同时排出隔离物之间的空气。

软件

图片集：Zen 2（Zeiss GmbH）
https://www.zeiss.com/microscopy/us/products /microscope-software/zen.html
图像处理：ImageJ（NIH）（Schindelin等人，2012； Schneider等人，2012）＆nbsp;
https://imagej.nih.gov/ij/

程序

一般准则：

在生物安全柜中执行所有步骤。致病性隐球菌是生物安全性为2级的生物。
正确的Khhler照明以及偏振片和棱镜的完美对准对于DIC显微镜至关重要。确保在执行实验之前检查这些设置。
在进行实时成像实验之前，先将胶囊诱导的细胞悬浮在Percoll ？和Sab-MOPS的50％（v / v）混合物中，以进行测试，以确保系统正确设置用于胶囊成像。
为了精确测量胶囊的大小，请确保使用千分尺对显微镜进行了正确校准。如果您的显微镜无法自动缩放，则在对隐球菌成像之前，需要先收集一个微米级的图像。
将细胞孵育以在密闭室中成像。在孵育系统组装过程中，最常见的错误是将金属零件拧得太松，导致在尝试用细胞悬液填充它时会导致腔室泄漏，或者导致垫片弯曲而不是被注射器针头刺破;或太多，导致玻璃板破裂。第一次进行实验之前，请先练习安装并加水。
实时成像实验非常具有挑战性，可能需要多次重复才能成功。以下是经常发生的问题的列表以及将其最小化的建议：
1. 由于细胞未附着在盖玻片上，因此它们经常向侧面移出视野。在带有电动工作台的显微镜中，可以在一定程度上最小化此问题。我们通常会进行实验，以收集一个由3 x 3场组成的面板，并将感兴趣的单元格置于中心。
2. 细胞也可能在Z轴上漂移，从而导致焦点丢失。我们通过收集至少11个间隔为1μm的切片的Z堆栈来最大程度地减少这种情况，最佳焦点位于中间。
3. 样在实验期间，有些细胞只是没有繁殖或没有明显诱导其胶囊。同样，使用电动载物台，我们在每个实验中从多个区域收集图像，以增加在至少其中一些区域中我们可以在单个细胞中观察胶囊几个小时的机会。

胶囊的静态成像
1. 获取隐球菌 spp。根据您的实验设计进行胶囊成像的细胞。我们已经成功地将来自 C的固体和液体培养基中培养的培养物的胶囊成像。新甲虫和 C。加蒂（Gattii）种复合菌株。
2. 用PBS稀释细胞，并与Percoll ？按1：1比例混合。我们对细胞悬浮液中的胶囊成像的浓度范围很广，从每毫升约10 3 到超过10 6 个细胞。
3. 将10μl混合物加到玻片上并盖上盖玻片。
4. 在DIC显微镜上观察细胞并成像。
胶囊生长的延时成像-准备细胞
1. 下午，用无菌牙签从新鲜的（不到两周）YPD琼脂平板上收集单个<隐>隐球菌菌落，并将其接种到装有5毫升YPD肉汤的培养管中。
2. 将酵母培养物在30°C和200 rpm的轨道振荡器中生长过夜。
3. 在同一天，按照制造商的指示，通过高压灭菌器对POCmini-2细胞培养系统的组件（使用1-mm垫片）进行灭菌。还要在安装培养室时高压消毒小镊子以保持无菌。
  注意：如果将已经部分组装的高压灭菌罐密封好一点，则在灭菌后更容易关闭灭菌腔。但是，请勿将其完全拧紧，因为不会对其进行有效的消毒。
4. 第二天早上，在开始处理酵母培养物之前，请打开显微镜并将加热系统设置为37°C，以预热整个机器，为实验做准备。
  注意：诸如Axio Z1之类的显微镜至少需要一个小时才能达到37°C。如果您忘记了此步骤，则会导致稍后的延迟。延时显微镜开始之前，显微镜必须处于孵育温度，因为其部件的热膨胀会改变焦平面。
5. 将2 ml的培养物收集到无菌的2 ml聚丙烯试管中，并在室温下在微量离心机中以1,000 x g 沉淀细胞5分钟。
6. 除去上清液，不干扰沉淀，将细胞重悬于1 ml无菌PBS，盐水或水中，将悬浮液转移至1.5 ml聚丙烯试管中，并在室温下以1,000 xg 重复离心5分钟。温度。再重复此清洗两次，以洗去培养液中的剩余物质。
7. 最后一次离心后，将细胞重悬于500μl的Sab-MOPS中60％的Percoll ？稀释液中。
8. 在室温下以2,000 x g 离心细胞5分钟。
9. 小心除去400μl上清液，不要干扰沉淀。通过上下移液重悬剩余的上清液中的细胞。
  注释：
  1. 为此步骤使用P200微量移液器。不要尝试去除所有上清液：在上一步形成的微小沉淀物非常疏松，如果尝试将被吸出。
  2. 步骤B7至B9是可选的，没有它们，我们已经成功进行了实验。可以完全跳过它们，将步骤B6中洗涤后的细胞重悬于PBS中，并按照步骤B10中的方法计数。但是，我们建议在Percoll？中进行离心，以使悬浮液富集比用于延时显微镜的50％Percoll？/ Sab-MOPS混合物致密的细胞（请参见下文）。在几个实验中，我们发现大多数隐球菌细胞的密度低于50％的Percoll？悬浮液，因此它们在孵育过程中从显微镜的焦平面浮起。 Percoll的60％混合物？与实际实验中使用的50％混合液相比，培养基中的混合液密度稍高，这确保了该步骤中任何密度足以沉淀的细胞都不会在稍后的培养箱中沉降。最终的颗粒含量为60％Percoll？通常很小，这就是为什么我们从至少2毫升的培养液开始。
10. 从步骤B9（或如果跳过了Percoll ？的离心步骤则从步骤B7）中收集10μl悬浮液的等分试样，以估计血细胞计数器中的细胞密度。在另一个试管中，准备1 ml的Percoll ？在Sab-MOPS中的50％混合物（包括抗生素，例如50μg/ ml的氨苄青霉素），然后从相当于1,000-2,000个细胞的步骤B9（如果您跳过在Percoll ？中进行的离心分离，则为步骤B7）。上下吹打均匀混合。
  注释：
  1. 我们使用如此少的细胞的原因是，孵育室中较高的细胞密度会导致孵育过程中相邻的细胞簇聚结，从而无法记录胶囊的生长情况。
  2. 在所有记录的胶囊诱导培养基中，我们已经用三种方法测试了该方案。不依赖二氧化碳的培养基（Ost等人，2015）比我们在此方案中描述的SAB-MOPS培养基产生的胶囊生长少。几小时后，最小培养基在37°C下与Percoll ？形成不透明的凝胶。
  3. 并非严格要求添加氨苄青霉素，但我们发现它可以避免有时在操作温育箱期间发生的细菌污染。
胶囊生长的延时成像-采集图像
1. 按照制造商的指示安装POCmini-2细胞培养系统。使用1毫米垫片，并用无菌镊子操纵玻璃板。
  注意：如上所述，在第一次进行实验之前，最好先练习用水安装和填充培养室。
2. 通过一个孔口插入一个无菌的30号针头，小心地刺穿垫片。
3. 用步骤B10的细胞悬液填充装有30号针头的1 ml胰岛素注射器。确保排出注射器中的所有空气。
4. 小心地用注射器针头刺穿垫片，使其穿过与步骤C2中插入针头相对的孔口。
5. 将细胞悬液缓慢注入POCmini-2中，使空气通过相反的针头排出。当腔室几乎充满时，在空气完全排出后，先小心地移开对面的针头，然后将注射器和针头与其余的细胞悬液一起取出。 POCmini-2用1毫米垫片固定约800微升。
6. 将POCmini-2放入显微镜中合适的样品架中，然后关闭培养箱。
7. 手动扫描POCmini-2的可见区域，以查明隔离的单个不动细胞。调整K？hler照明度和DIC滑块以获得最佳对比度。
  注意：由于POCmini-2中引入的细胞很少，因此找到它们需要时间和耐心。切换到10倍物镜可以粗略地找到合适的焦点，这很有帮助，但是只有在工作距离为10倍物镜的情况下才能这样做，以免被浸油弄脏。
8. 使用显微镜固件（在我们的情况下为Zen 2），设置设备以在24-72小时内每5-15分钟收集一次图像。
9. 等待约20分钟，并确认所选的单元格仍然可见并且在适当的位置，然后再开始实验。

数据分析

在DIC图像中测量胶囊厚度

根据以上协议收集图像。根据用于操作显微镜的软件的不同，以专有格式备份原始数据，以确保保留所有元数据。对于Zeiss ZEN软件，此格式为.czi。
Zeiss ZEN软件可实现自动缩放并具有测量工具。为此，选择“圆形（直径）”（图3）或“长度”工具，然后首先测量电池的总直径，包括胶囊。接下来测量细胞体直径。对每个图像中的所有细胞重复此操作，直到测量50个细胞。
将数据传输到您喜欢的软件进行统计分析和图形化。
要获得胶囊厚度，请从整个细胞直径中减去细胞体直径，然后将该值除以二。要获得胶囊体积，请从整个细胞体积中减去细胞体体积。

图3.在Zen 2上测量细胞和胶囊直径。选择“图形”>圆（直径）。这将启用单击和拖动功能，从而您可以在单元格或胶囊上绘制一个圆圈，一旦释放光标，您将看到其直径和面积。然后将这些值转录到电子表格中，以计算胶囊的宽度和体积。调整图像的亮度和对比度以提高清晰度。

笔记

只要装有高数值孔径的物镜，DIC棱镜和偏光镜，就可以在简单的直立或倒置显微镜中轻松地进行胶囊的静态观察。胶囊生长的实时成像需要专门的倒置显微镜，该显微镜配有温度控制装置和孵育室以及软件控制的图像采集装置。
高质量的光学器件在使用此协议对胶囊成像的能力上有很大的不同。使用高数值孔径，平场复消色差物镜可获得最佳图像。
大多数显微镜均经过优化，可对170μm厚的盖玻片下的样品成像。最常用的盖玻片的厚度明显偏离此最佳值。尽管价格昂贵且较难找到，但＃1.5H（170μm厚）盖玻片的确在获得良好胶囊图像（尤其是实时成像）所需的高数值孔径时，在图像质量上有所不同。
其他可商购或自制的培养箱可能适用于实时成像。但是，最常见的那些（玻璃底平板和多孔室）由于蒸发改变了真菌在Percoll？中的悬浮液而导致效果不佳。变成不透明的凝胶。重要的是使用170μm厚的玻璃底腔室，该腔室可以关闭以避免蒸发。

菜谱

Percoll ？ / Sab-MOPS悬架
1. 为确保Sabouraud培养基和MOPS的最终浓度等于Zaragoza和Casadevall（2004）的原始描述的浓度（分别为10％和50 mM），请准备四倍浓缩的储备液：
  MOPS 200 mM，pH 7.5
  Sabouraud葡萄糖肉汤（见下文）稀释2.5倍（v / v）
2. 要制备50％或60％的Percoll ？稀释液，请按以下比例混合每单位体积：
  50％或60％的Percoll ？
  步骤a中制备的溶液的25％
  根据需要悬浮酵母（如果您跳过在Percoll ？中进行的离心分离，则进行步骤B9或步骤B7）
  无菌去离子水完成体积，加抗生素
YPD肉汤和琼脂
1. 溶于去离子水（m / v）：
  酵母提取物含量为1％
  蛋白at含量为2％
  葡萄糖为2％
2. 用盐酸将pH调节至5.3-5.6
3. 要制作固体培养基，请添加1.5％（m / v）的琼脂
4. 高压灭菌
Sabouraud葡萄糖肉汤
1. 溶于去离子水（m / v）：
  葡萄糖含量为4％
  1％蛋白at
2. 用盐酸将pH调节至5.3-5.6
磷酸盐缓冲盐水
1. 溶于去离子水（m / v）：
  137毫米氯化钠
  2.7 mM氯化钾
  10 mM Na 2 HPO 4
  1.8 mM KH 2 PO 4
2. 用盐酸将pH调节至7.2-7.4，并通过高压灭菌或过滤法进行灭菌
氨苄西林溶液
将100 mg / ml的氨苄青霉素溶解在去离子水中，并通过过滤灭菌

致谢

美国国家卫生研究院（National Institutes of Health）资助5R01A1033774、5R37AI033142和5T32A107506，以及CTSA资助（来自国家转化科学发展中心的1 ULI TR001073-01、1 TLI 1 TR001072-01和1 KL2 TR001071）。 HP，MF和AN目前得到巴西资助机构CNPq，FAP-DF和Capes的赠款支持。该协议改编自我们之前发表的工作（Paes et al。，2018年）。

利益争夺

作者报告没有利益冲突。

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