材料和试剂

super SIL组件
1. 超半球球形透镜，立方氧化锆，直径0.89毫米x厚度0.73毫米，λ\ 4平坦度（Knight Optical，LBB2018-C）
2. 铂箔（Goodfellow，目录号：PT000264 876-861-73）
3. 低温兼容粘合剂（乐泰Stycast，2850英尺）
制备细菌和基准溶液
1. 平盖离心管，50毫升（Fisherbrand，目录号：05-539-13）
2. Eppendorf管，2 ml（Eppendorf，目录号：0030 123.344）
3. Tetraspeck 0.1μm蓝色/绿色/橙色/深红色小珠（分子探针，Thermo Fisher Scientific，目录号：T7279）
4. 带有表达 E.Coli 克隆的目的质粒的琼脂平板
5. LB中等颗粒（例如，梅尔福德，L24400-5000.0）
6. 用于水中pH调节的1 M HCl溶液（由HCl 37％ACS级320331，Sigma-Aldrich制成）
7. 水中选择的抗生素储备溶液（例如，卡那霉素25 mg / ml，来自Sigma-Aldrich粉末，K1377;羧苄青霉素100 mg / ml现成的溶液，Sigma-Aldrich，C1613）
8. IPTG 1 M储备水溶液（由粉末例如，Fluorochem，M02726组成）
9. PBS 1x pH 7.4（Gibco，目录号：10010-015）
10. 超纯去离子水（MilliQ或同等水平）
11. LB培养基（请参阅食谱）
清洁 super SIL组件
1. 清洁载玻片（例如，Fischer Scientific 16 x 38 mm显微镜载玻片244879）
2. 滤纸（例如，定性滤纸A级，SLS 2036）
3. 干净的玻璃闪烁瓶（例如，Thermo Chromacol 20 ml瓶20-EPSVCA）
4. super SIL组件（按程序A所述生产），立方氧化锆晶体NA 2.17
5. 硫酸纯度≥95％（例如，Fischer Scientific S / 9231 / PB15）
6. 30％过氧化氢与抑制剂，ACS级（ e.g。，Sigma-Aldrich，目录号：216763）
7. 至少100毫升MilliQ（或同等水平）水
8. 食人鱼解决方案（请参阅食谱）
急冻
1. 乙烷气瓶
2. 清洁并排放辉光的 super SIL（按程序D所述进行制备）
3. 细菌悬浮液（按照步骤B所述制备）
4. 基准悬架（如程序C中所述进行制备）
5. 液氮（至少4升杜瓦瓶）
6. 70％乙醇
7. MilliQ水

设备

super SIL组件和显微镜
1. 陶瓷热板（VWR，目录号：444-0624）
2. 坐标测量机（OGP，SmartScope ZIP 250）
显微镜支架
1. 带有Epi照明臂的Cerna显微镜镜身（Thorlabs，目录号：CEA1350）
2. 尼康D-FL Epi荧光照明器（Thorlabs，目录号：CSE1000）
3. 尼康TE2000的显微镜立方体组件（Thorlabs，目录号：TLV-TE2000）
4. 单物镜臂（Thorlabs，目录号：CSA1100）
5. 物镜聚焦模块（Thorlabs，目录号：ZFM2020）
6. 用于1“ Cerna位移台的3轴控制器和旋钮盒（Thorlabs，目录号：MCM3001）
7. TIRF模块，包括X / Y转换器和直角镜安装架（Thorlabs，ST1XY-D和KCB1 / M）
8. 翻译阶段（以前的H117P2IX / G）
9. 平移台控制器（PriScan，ProScan III H31XYZEF）
10. 图像分割模块（Cairn，Twincam）
光学元件，样品台和照相机
在图1所示的显微镜示意图中使用了以下组件。原则上，可以从Linkam Scientific Ltd获得各种用于冷冻台的转接板，并且可以从Cairn Twincam罐上改装大多数流行的商用显微镜支架以创建类似的配置。可以在输入和输出端口上使用C型安装螺纹购买，以适合大多数类型的科学相机。
注意：在低温下检查所选荧光团或染料的发射光谱，并选择适合的二向色和发射滤光片。通道之间的色差可以通过更改镜头的强度16和sCMOS相机2的轴向平移来补偿。
1. l 1 ：f = 30毫米消色差双合透镜（Thorlabs，目录号：AC254-030-A-ML）
2. l 2 ：f = 150毫米消色差双合透镜（Thorlabs，目录号：AC254-150-A-ML）
3. l 3 ：f = 100毫米消色差双合透镜（Thorlabs，目录号：AC254-100-A-ML）
4. l 4 ：f = 150毫米消色差双合透镜（Thorlabs，目录号：AC254-150-A-ML）
5. l 5 ：f = 200毫米1倍镜筒镜头（Thorlabs，目录号：WFA4100）
6. l 6 ：f = 500 mm B-BK7平凸透镜（Thorlabs，目录号：LA1908）
7. l 7 ：50x，0.75 NA显微镜物镜（Mitutoyo，M Plan Apo HR 378-814-4）
8. p 1 ：30μm针孔（Thorlabs，P30D）
9. t 1 ：高顶光束成形光学器件（TOPAG Lasertechnik GmbH，GTH-5-250-4-VIS）
10. d 1 ：二向色分束镜（Semrock，Di-R405 / 488/561/635）
11. d 2 ：二向色分束器（色度，t565lpxr）
12. f 1 ：四频发射滤波器（Semrock，FF01-446 / 523/600 / 677-25）
13. f 2 ：绿色通道带通滤波器（Semrock，目录号：FF03-525 / 50-25）
14. f 3 ：红色通道带通滤波器（Semrock，目录号：FF01-593 / 40-25）
15. q 1 ：消色差四分之一波片（Thorlabs，AHWP10M-600）
16. m 1 ：宽带介电镜（Thorlabs，BB1-E02）
17. 包含四个激光模块的Omicron LightHUB-6
  1. 405 nm 60 mW福克斯二极管激光器
  2. 488 nm 200 mW福克斯二极管激光器
  3. 561 nm 150 mW Cobolt Jive DPSS激光器
  4. 642 nm 140 mW福克斯二极管激光器
18. 两个具有18.7 mm芯片传感器尺寸的背照式sCMOS相机（Teledyne Photometrics Ltd，18.7 mm Prime 95B）
19. 具有自动填充杜瓦瓶（Linkam，CMS196M和AUTOFILL）的低温台
  
  图1.显微镜原理图，详细说明光学器件布局
制备细菌和基准溶液
1. 摆桶式离心机（例如，贝克曼库尔特Allegra X-15R离心机）
2. P1000，P100和P10移液器和吸头
3. 高压灭菌器（例如，Prestige Medical Classic台式高压灭菌器）
4. 分光光度计（例如，Amersham Biosciences Ultrospec 10细胞密度仪）
5. MSC机柜（例如，Scanlaf Mars安全等级2）
6. 温度控制的搅拌培养箱（例如，New Brunswick Scientific Innova 44R）
7. 涡流（例如，IKA MS2 minishaker）
8. 浸入式pH计（例如，Hanna PH21）
清洁 super SIL组件
1. 化学通风柜
2. P1000移液器和吸头
3. 辉光放电器（例如，Quorum GloQube）
4. 倒镊子（例如，Dumont N1）
5. 计时器
急冻
1. FEI Vitrobot或同等的柱塞式冷冻机
2. 易燃气体调节器（例如，液化空气HBD-240-4-2.S）
3. 气体泄漏检测器（例如，Everbuild Plumber的P18气体泄漏检测器）
4. 倒镊子（例如，Dumont N1）
5. 弯曲镊子（例如，Dumont 7，0130-7-PO）
6. 印迹纸（例如，Vitrobot的Agar圆形滤纸，47000-100）
7. P10移液器和吸头
8. 1 L保温瓶
9. 漏斗
10. 卫生纸
11. 网格箱（例如，SwissCI cryo-EM网格箱MD16-104，Molecular Dimensions Limited）
12. 50毫升离心管连接到一块合成的非吸收性麻线上
13. 运输低温战（例如，Statebourne低温OD-1）
14. 手持式液氮杜瓦瓶（例如，沃辛顿LD4）
15. 存储孤岛战（例如，沃辛顿VHC35）
16. 电热板或吹风机
17. 足够用于低温工作的个人防护设备（PPE）（请参阅您所在机构的当地健康和安全法规）
18. 可选：PFTE螺纹密封胶带（例如，布法罗12 m x 12 mm x 0.075 mm BS7786：2006 Grade L）
19. 可选：局部排气通风（LEV）进口
20. 可选：可定向的台灯
21. FEI Vitrobot或同等湿度控制器

软件

Micro-Manager v1.4.23 20161114（Edelstein等，2014）
Omicron控制中心v2.1.4
ImageJ版本v1.52h（Schindelin等，2015）
ThunderSTORM v1.3-2014-11-08插件（Ovesny et al。，2014）

程序

制造superSIL组件
注意：此步骤假定使用配备有激光切割机和干燥箱的机械车间。

图2. superSIL组件的制造过程。 A.直径3 mm的铂金圆盘，中心有一个直径为1 mm的激光切割孔。 B.装配好的 super SIL的光盘。比例尺：1毫米。
1. 使用激光切割机从铂箔上切出一个直径为3毫米的圆。在中心钻一个直径为1毫米的孔（如图2A所示）。
2. 使用低温兼容粘合剂将 super SIL胶粘到孔中（如图2B所示）。
3. 在45°C下，将组件在烤箱中固化24小时。
4. 使用坐标测量机测量 super SIL平面与铂金圆盘平面之间的角度。平坦度＆lt; 1°对于最大程度地降低成像像差至关重要。
细菌悬浮液的制备
注意：通过在MSC或本生灯旁边的所有步骤进行步骤B6之前，可以保持培养物的无菌性。
该过程假定所选的细菌菌株表达适合SMLM的荧光蛋白。我们已经成功使用增强型GFP（EGFP）进行了成像（Wang等，2019），并且已有报道使用单体EGFP和mVenus进行冷冻SMLM（Kaufmann等）。 >，2014年）。
1. 在10 ml LB琼脂中接种目标细菌菌株的一个菌落。
2. 根据目标质粒上存在的选择标记添加选择抗生素。
3. 在37°C 220 rpm下生长3小时，然后检查外径。在分光光度计上用660稀释，使用LB介质（配方1）作为空白。
4. 如果文化达到了外径约0.6，用IPTG 0.2-1 mM诱导（具体情况必须根据具体情况进行优化），并在25°C下培养18 h。
5. 保持培养物无菌，取2 ml培养物并将其转移到2 ml Eppendorf中。
6. 于3,000 x g 离心10分钟，弃去上清液。
7. 加入2 ml PBS，重悬并于3,000 x g 离心10分钟，然后弃去上清液。
8. 重悬于100μlPBS 1x中，置于冰上。
基准悬架的制备
1. 以最大设置涡旋Tetraspeck小瓶至少10 s。
2. 用MilliQ（或同等纯度）的水将Tetraspeck 1:10稀释。
3. 在最大设置下涡旋稀释的珠悬浮液至少10 s。
4. 保持冰上。
清洁 super SIL组件
每次使用后，应在使用新样品之前使用此程序清洁 super SIL。这使得 super SIL组件可重复使用几个周期。清洁会使将镜头附着在铂金盘上的胶水退化。当 super SIL松动时，可以按照过程A中的说明重新安装。

重要的安全建议
1. Piranha溶液是高度酸性的，会氧化并放热。不要制造超出所需的数量，不要在制造时盖住小瓶，也不要存放。始终使用适当的PPE。专门在通风橱下准备和使用食人鱼。
2. 请勿与有机溶剂混合，否则可能会引起爆炸。
3. 请勿使用浓度超过30％的过氧化氢，否则可能引起爆炸。
4. 使用后，用大量MilliQ水稀释剩菜，将其放气并在通风橱中降解过夜，然后将其与大量冷水一起排入下水道。
5. 此过程在视频1中得到了直观展示。
  
  视频1. SuperSIL清洁过程
1. 按照食谱中所述准备食人鱼溶液（配方2）。
2. 现货〜100μl干净玻璃载玻片上的食人鱼溶液。为每个要清洁的 super SIL准备一个斑点。
3. 用一对镊子将每个 super SIL放在Piranha溶液的一个点上，面朝下。
4. 在室温下孵育7分钟。
5. 使用一对倒镊子，将每个 super SIL浸泡在MilliQ小瓶中，然后在干净的滤纸上吸干，以彻底冲洗。重复扣篮和吸墨至少三遍。
6. 使用干净的MilliQ小瓶再次重复步骤D5。
7. 让 super SILs在干净的滤纸上干燥至少1小时。
8. 辉光放电器中的辉光放电 super SILs在40 mA下以120 s的平面朝上向上放电。
柱塞冻结
重要安全声明
1. 协议的这一步骤需要使用低温剂和易燃气体，它们可能会因氧气置换而引起低温灼伤，爆炸和窒息。始终佩戴适当的个人防护装备，并确保您在有足够通风和氧气耗尽警报的区域中工作。请始终参阅有关在您的工厂中使用低温和易燃气体的健康和安全指南。开始工作之前，请先进行适当的培训和/或监督。
2. 假定使用Vitrobot浸入式冷冻机（FEI）进行说明。请参阅制造商的说明，以了解如何将其翻译为与其他制造商的等效设备一起使用。
  
  图3. Vitrobot浸入式冷冻机的冷冻浴
视频2中直观地演示了此过程。
1. 打开总开关上的Vitrobot并安装湿度控制器。
2. 将湿度设置为70％，温度设置为22°C。等待直到它们平衡（通常25-30分钟）。
3. 在选项菜单中，将印迹数设置为零，并允许使用脚踏板。
  注意：需要禁用自动印迹，以保持superSIL的结构完整性。
4. 用约1 L的液氮填充冷冻浴的外腔。确保“蜘蛛”到位（如图3所示）。
  注意：请勿直接从手持式杜瓦瓶中加满水，而要用它来填充较小的热水瓶。使用漏斗和薄纸过滤掉可能污染样品的宏观冰晶。
5. 等待10至15分钟，使内室冷却并将网格盒放入专用插槽中（最多4个盒，因此一次最多可容纳16个样品）。
6. 将调节器安装在乙烷瓶上，并使用检漏仪喷雾器检查是否泄漏。
  注意：如果检测到泄漏，请关闭所有阀门并重新启动。如有必要，使用PVDF胶带包裹调节器螺纹。遵守有关可燃气体使用的地方安全法规。
  
  视频2. SuperSIL骤冷过程
7. 将乙烷缓慢地分配到内杯中，然后等待直到乙烷几乎充满为止，以除去蜘蛛网。乙烷应处于液态，以进行骤冷。如有必要，可通过将热金属仪器插入乙烷内杯中来熔化固化的乙烷。
  注释：
  1. 将局部排气通风（LEV）头靠近冷冻浴放置，对于更准确地清除冷的乙烷蒸气和进行测量非常有帮助。
  2. 在以下段落中，需要将蜘蛛取下。否则可能会严重损坏计算机。
8. 用兼容Vitrobot的镊子装上 super SIL，确保平坦的一面朝向您惯用或惯用的手的侧面，并将其加载到轴上。
  注意：请确保镊子不在轴的两侧，因为当轴缩回时，这可能会严重损坏机器。
9. 踩踏板将镊子缩回等待位置。
10. 将低温浴放在基座上，然后踩踏板以抬起。
11. 冷冻浴完成移动后，按踏板将镊子降低到样品加载位置。
12. 通过侧面端口将2.5μl细菌悬浮液施加到 super SIL的平坦侧。
13. 打开前门，用一张滤纸将大部分液体吸干。
14. 重复样品施加和印迹。
15. 通过侧面端口将2.5μl基准溶液施加到 super SIL的平坦侧面。
16. 重复步骤E13。
17. 踩踏板开始跳入序列。
18. 一旦轴和冷冻浴到达过程的终点，请在外腔中注满液氮，从轴上卸下镊子，然后将 super SIL从乙烷杯中移入氮气中洗澡。
  注释：
  1. 在这个阶段，可定向的台式灯产生的额外光非常有用。
  2. 将镊子从乙烷中缓慢取出，以防止液态乙烷粘附到superSIL表面，然后在液态氮中快速转移。
19. 小心释放镊子的卡子，并将 super SIL放在网格盒的一个插槽中。
20. 使用加热板或吹风机加热并干燥所有仪器。
  注意：每次取样后，用70％的乙醇洗涤Vitrobot镊子，并使其干燥以防止 super SILs交叉污染。
21. 一旦所有样品都投入后，用液氮填充运输杜瓦瓶并使其沉降。
22. 在运输杜瓦瓶内部的管子上冷却管子。
23. 使用冷镊子，将格栅盒从Vitrobot低温浴的外部氮气浴快速转移到试管中。
24. 将样品保存在充满液氮的杜瓦瓶中，直到准备成像（不超过一个月）。
样品转移至低温台

图4.移除盖子的Linkam冷冻台布局
1. 开启Linkam CMS196M冷冻台并执行烘烤周期。
2. 用液氮填充Linkam Autofill杜瓦瓶，然后连接到CMS196M平台。启动冷却台的冷却。
3. 冷冻室内的温度平衡到-196°C后，将Linkam样品转移圆盘插入冷冻室内的一个空容器中，然后冷却。插入空白样品盒（如图4所示）。
4. 将包含您的 super SIL样品的储存圆盘转移到冷冻室中的其余容器中。
5. 使用镊子将 super SIL组件从存储圆盘转移到样品盒中，要密切注意方向；安装后， super SIL的弯曲表面需要指向显微镜物镜。
6. 一旦安装了 super SIL，请关闭盒式磁带，然后使用磁性传输工具将其传输到黄铜桥。从冷冻室中取出储存器和转移圆盘，以最大程度地减少成像过程中的振动。
注意：在样品转移过程中，最大程度地减少样品被冰污染和去玻璃化的可能性至关重要。在潮湿的环境中，由于呼吸和未使用加热板进行预干燥的工具所凝结的结果，可能会形成冰晶。
寻找焦点

图5.在明场照明下寻找焦点。在50x 0.75 NA物镜下， super SIL曲面的顶部显示为聚焦在（A）中。通过 super SIL观察，在（B）中所示的明场照明下，应该可以看到平坦表面上的特征性划痕，表明样品平面已对准焦点。比例尺：10μm。
1. 启动Micro-Manager，并显示摄像机的实时视图。
2. 打开Linkam CMS196M内置的明场电容器LED。
3. 将显微镜物镜降低到 super SIL的Linkam室。监控绿色通道摄像机的输出。密切注意物镜与 super SIL之间的距离；碰撞可能会损坏Linkam黄铜桥，从而导致大量维修费用和延误。
  注意：红色LED通道不太可能出现内置LED聚光镜发出的光。
4. 当物镜接近 super SIL时，您会注意到绿色通道的亮度增加。横向调整显微镜载物台，以确保在您进一步降低物镜时，最亮的区域保持在相机视野的中心。
5. super SIL的曲面将聚焦。横向移动显微镜载物台，使曲面的最顶部位于相机视场的中心（图5A），并且外围模糊而无法聚焦。
6. 现在将物镜降低大约1毫米，以找到位于 super SIL平面下方的虚拟成像平面。您会发现 super SIL平面上的固有划痕首先成为焦点（图5B）。如果在急冻过程中产生的冰相对较薄，则样品所在的平面应非常接近 super SIL的平面。
影像
注意：您可以选择将收集的图像存储在内存中或直接将其流式传输到硬盘。 sCMOS相机会产生大量数据，因此请确保继续之前有足够的可用空间，否则系统可能会变得无响应并崩溃。每个通道包含10,000个全帧的典型双色STORM实验消耗大约10 GB的数据。最低要求建议使用等于或大于32 GB的计算机内存以及容量等于或大于1 TB的固态硬盘。
1. 拍摄可选的明场图像快照。关闭LED电容器。
2. 所需的激光充分加热后，再打开它们。
3. 打开显微镜上的激光快门以照亮样品。
4. 微调物镜高度，直到基准标记对准焦点。
5. 可选：调整TIRF模块上的千分尺以增加样品的对比度。
6. 从低激光功率密度（〜50 W / cm 2 ）开始。等待样品充分的光漂白，直到看到清晰的分离良好的单分子闪烁。如有必要，请增加激光功率密度，直到观察到所选荧光团所需的闪烁特性为止。与在黑暗状态下花费的时间相比，分子在其发光状态下花费的时间应尽可能短。
7. 根据您选择的荧光团和样品条件，调整相机的曝光时间并为实验获取适当数量的帧。对于 E。含有eGFP的Coli ，我们选择以50毫秒的曝光时间获取10,000帧。
8. 将获取的帧另存为16位无符号整数TIF堆栈。
9. 反向执行“查找焦点”步骤，以从冷冻显微镜载物台安全地取出样品。

数据分析

单分子定位
1. 打开ImageJ并加载感兴趣的TIF堆栈。
2. 运行ThunderSTORM插件。在“摄像机设置”下验证您的摄像机设置正确，并且已根据理论点扩展函数大小输入了合适的拟合和亚像素定位设置（图6）。
3. 选择所需的方法以可视化重建的图像。
4. 单击“预览”以查看分析如何处理当前数据帧并验证其检测到所有可见的单个分子。
5. 单击“确定”以对整个数据集运行分析。
6. 分析完成后，您会注意到结果表出现在屏幕上，与重建的图像一起。使用“导出”功能将结果表另存为.csv文件，因为此功能可在以后用于重新生成重建的图像。
  
  图6.基于有效点扩散函数和 super SIL
  成像平面上像素大小的典型ThunderSTORM设置
漂移校正
1. 如果基准标记存在且处于焦点位置，则可以对数据集应用漂移校正。单击“漂移校正”选项卡，然后通过单击双箭头图标加载子菜单。我们已经发现，在我们的特定低温阶段，考虑到漂移的性质，在漂移校正选项下，将最大距离设置为500 nm，最小标记比设置为0.9，轨迹平滑因子设置为0.001可获得令人满意的结果。
2. 一旦计算并应用了漂移校正，就会出现一个新的重构，以反映这些变化。使用ImageJ工具栏中的放大镜工具放大以检查基准标记；如果仍然有明显的漂移，则可能需要调整上一步中讨论的变量。
3. 使用“导出”功能将修改后的结果表另存为.csv文件。
过滤
注意：ThunderSTORM中的拟合算法可用于消除由冰晶，聚集基准点，样品自动荧光或散射等来源引起的不必要的定位伪影。
1. 在“过滤器”选项卡上，您可以使用布尔代数表达式定义所需的过滤器。
2. 例如，如果您的系统具有125 nm的理论点扩散函数sigma，则可以选择仅包括sigma在100-150 nm范围内的那些定位，并使用表达式“ sigma＆gt; 100和sigma＆lt; 150”。
3. 您感兴趣的样品可能具有100-1000 ADU计数的强度范围，而基准标记的强度超过6000 ADU计数。在这种情况下，您可以使用表达式“ intensity＆lt; 6000”。
可视化和测量
1. 通过选择“文件”>“颜色”，可以将颜色查找表（LUT）应用于重建的图像。导入＆gt; LUT…”。
2. 需要正确定义像素大小，以便在重建的图像中进行测量。可以通过选择重建的图像窗口并导航到“ Image＆gt;属性”。像素大小应设置为相机的像素大小，再除以ThunderSTORM可视化设置中使用的最终放大率。例如，如果您的像素大小为46.8 nm，并且选择了5倍的最终放大倍数，则您重构的像素大小为9.36 nm。
3. 现在，您可以使用ImageJ主工具栏上的标尺工具测量要素之间的近似距离。
先进的数据分析
ThunderSTORM生成的.csv数据表可以导入其他软件包中以进行高级数据分析，包括单分子聚类，化学计量和通道之间的共定位。

菜谱

LB培养基
1. 称出25克颗粒
2. 加入1升MilliQ水
3. 使用HCl将pH调整至7.2
4. 高压灭菌器消毒
食人鱼解决方案
1. 将900μl浓硫酸加入玻璃闪烁瓶中
2. 向小瓶中加入300μl的30％过氧化氢并快速混合
  注意：小瓶会明显加热。
3. 立即使用。不要盖上样品瓶
重要的安全建议
1. Piranha溶液是高度酸性的，会氧化并放热。不要制造超出所需的数量，不要在制造时盖住小瓶，也不要存放。始终使用适当的PPE。专门在通风橱下准备和使用食人鱼。
2. 请勿与有机溶剂混合，否则可能会引起爆炸。
3. 请勿使用浓度超过30％的过氧化氢，否则可能引起爆炸。
4. 使用后，用大量MilliQ水稀释剩菜，使其脱气并在通风橱中降解过夜，然后将其与大量冷水一起排入下水道。
5. 此配方可制成足够的Piranha解决方案，以上述方法清洁20多种superSIL。请注意，如果制备更大的量，与食人鱼溶液制备相关的危险会增加。对于大于5毫升的溶液，应始终在冰上制备溶液，以尽量减少热量。

致谢

这项工作由医学研究理事会授予MMF的MR / K015591 / 1资助。该协议基于Wang 等人。（2019）中发表的工作。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

参考文献

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