材料和试剂

生态腈PF 250手套（ecoSHIELD TM ）
组织培养瓶25版本“通风口”（TPP ？，目录号：90025）
微量离心管1.5 ml（Corning，Axygen ？，目录号：MCT-175-C）
50 ml注射器（B.Braun Medical，目录号：4617509F-02）
聚丙烯锥形15 ml离心管（TPP Techno Plastic Products，目录号：91015）
聚丙烯锥形50 ml离心管（TPP Techno Plastic Products，目录号：91050）
BD Micro-Fine TM + U-100胰岛素注射器0.5 ml 0.33毫米（29G）x 12.7毫米（BD Medical，目录号：324824）
2 ml血清移液器（FALCON ？，目录号：357507）
10 ml血清移液管（SARSTEDT，目录号：86.1254。001）
25 ml血清移液管（SARSTEDT，目录号：86.1685.001
0.22μm注射器过滤器（Carl Roth，目录号：P668.1）
真空过滤500“快速” -Filtermax，PES膜孔径为0.22μm（TPP ？，目录号：99500）
6-9周龄无特定病原体的C57BL / 6女性麦克风
Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：14040091），在4°C下储存
施耐德的果蝇培养基，含L-谷氨酰胺和0.40 g / L NaHCO 3 （PAN TM BIOTECH，目录号：P04-91500），储存于4°C
胎牛血清（FBS）（Thermo Fisher Scientific，Gibco TM ，目录号：10270106），在-20°C下保存
HEPES缓冲液（1M）（BioConcept，目录号：5-31F00-H），在4°C下储存
青霉素-链霉素（P / S）溶液（10.000 IU / ml P / 10 mg / ml S）（Bioconcept，目录号：4-01F00-H），储存在4°C
猪的Hemin BioXtra（Sigma-Aldrich，目录号：51280），在4°C下储存
叶酸（Fluka TM ，目录号：47620），在4°C下储存
6-生物蝶呤（Sigma-Aldrich，目录号：B2517），储存在-20°C
二甲基亚砜（DMSO）细胞培养等级（AppliChem GmbH，目录号：A3672）
氢氧化钠？颗粒，每年98％，ISO（卡尔·罗斯，目录号：6771.1）
戊二醛技术溶液，约50％的H 2 O（5.6 M）（Fluka TM ，目录号：49629），存储在4°C下
70％乙醇F25 ？（在H 2 O中）（Alcosuisse）
VivoGlo TM 荧光素，体内级（Promega，目录号：P1041），储存在-20°C
表达利什曼原虫 guyanensis 寄生虫M4147（MHOM / BR / 75 / M4147）的荧光素酶转染子
Attane TM 异氟烷广告。兽医。（Provet AG，目录号：covetrus 722 2222）
完整的寄生虫培养基（请参见食谱），储存在4°C
热灭活的FBS（请参阅配方）
生物蝶呤（请参阅食谱）
叶绿素（见食谱）
寄生虫固定液（请参阅食谱），储存在4°C
萤光素溶液（请参阅食谱），储存在-20°C

设备

Forma TM Steri-Cycle TM CO 2 培养箱在26°C下（Thermo Fisher Scientific，目录号：371）
移液器控制器（INTEGRA，目录号：155017）
移液器（Gilson ？）＆nbsp;
计数室经过改进的Neubauer（Assistant ？，目录号：40442）
5810 R离心机（Eppendorf）
台式pH计（梅特勒-托利多）
水浴（朱拉波）
层流罩寄生虫培养（SafeFAST Premium）
层流罩鼠标处理（Scanlaf Safe 1200）
带4个流量计的组合式麻醉机（Rothacher Medical GmbH）
用于麻醉系统的O 2 浓缩器MIC 02 10 lpm（Rothacher Medical GmbH，目录号：CV 10-101 MIC 10 lpm）
麻醉废气过滤器（Aldasorber 1400g）
兽医麻醉诱导室/用于啮齿动物（Rothacher Medical GmbH，目录号：PS-0346）
体内成像系统（ In-Vivo Xtreme II，布鲁克）
带有HEPA过滤器（布鲁克）的 In-Vivo Xtreme TM II SPF动物室（SPFC）
倒置显微镜（Olympus CKX41）
倒置共聚焦显微镜（Zeiss LSM 800）
电脑（Windows 7）

软件

分子成像（MI）软件版本7.5.3.22464版（布鲁克（BRUKER））
GraphPad Prism软件版本8.1.0（GraphPad）

程序

表达利什曼原虫 guyanensis （ Lgy ）寄生虫的荧光素酶转染子的制备
注意：寄生虫来自亲本菌株Lgy M4147（MHOM / BR / 75 / M4147），并表达萤火虫荧光素酶（5 x 10 7 光子/秒/ 10 6 < / sup>寄生虫）稳定整合到核糖体RNA基因座的小亚基中（Lye et al。，2010）。寄生虫原液保持在液氮中。从冷冻小瓶开始时，将小瓶浸入26°C的水浴中即可快速融化寄生虫。将寄生虫转移到15 ml试管中，加入5 ml Schneider培养基（不完全），重悬并在26°C下以2000 x g离心8分钟。除去上清液，重悬于5 ml完全寄生虫培养基中，然后转移到25 cm 2 烧瓶中。在26°C和5％CO 2 中孵育。寄生虫在文化中传代的代次不超过五次。从老鼠脚垫中分离出这些寄生虫，以保持其毒力并避免纯化纯化的亚环前鞭毛体，从而降低了纯化过程中可能发生的LPS污染风险，并会激活先天免疫反应并可能影响读数。
1. 使用25 cm 2 烧瓶在10 ml完全寄生虫培养基中稀释100μl寄生虫（约5 x 10 6 寄生虫）（配方1）。
2. 将寄生虫在26°C和5％CO 2 下孵育6天。
3. 在培养的第6天，确认寄生虫处于稳定的生长期（图1）。
  注意：寄生虫每天都会计数，一旦它们进入静止期，就会被用于小鼠感染。
4. 计数寄生虫：
  1. 取出10μl的寄生虫培养物，并将其转移到装有990μl寄生虫固定液的1.5 ml微量离心管中（方案5）。
  2. 等待3分钟。
  3. 取10μl放在计数室中。
  4. 使用具有20倍物镜的倒置显微镜对寄生虫进行计数。
5. 在DPBS中将寄生虫数量调整为20 x 10 6 / ml。
  
  图1.培养6天后的Lgy寄生虫。代表固定相中的寄生虫的图像，形成大的团块（也称为“玫瑰花”）。 A. 10倍物镜，无变焦。 B. 10倍物镜，4倍变焦。使用共聚焦显微镜的明场图像。比例尺代表20μm。
Lgy 寄生虫感染的小鼠
注释：
1. 所有小鼠处理步骤均在洁净条件下在层流罩中进行。我们之所以使用C57BL / 6，是因为它们表现出可治愈的表型，因此在小鼠上的重力较小，甚至在组织较暗的情况下，也可以测量出光的透射率（Ives 等人 2011）。
2. 将寄生虫调整为20 x 10 6 寄生虫/ ml后直接接种到小鼠中。可以在一个或两个脚垫中进行寄生虫注射，没有任何区别。
1. 稍微麻醉小鼠：
  1. 填充异氟烷罐（视频1，第1部分）。
  2. 开启O 2 集中器。
  3. 将Combi-vet麻醉机的调节旋钮设置为异氟烷浓度的3％。
  4. 打开连接到进气室的流量计。
  5. 将小鼠转移到诱导室并对其进行麻醉。
2. 使用U-100胰岛素注射器每只小鼠的一只或两只后足垫皮下注射20μ10 6 / ml的50μl寄生虫（最终 Lgy 浓度：10 <每个脚垫上的sup> 6 寄生虫）。
  
  视频1.荧光素注射和图像采集演示。该视频演示了如何使用异氟烷麻醉系统，如何在小鼠体内注射萤光素（步骤C2），如何将小鼠麻醉并转移至SPFC室（步骤C3）以及如何使用In-vivo Xtreme II系统进行图像采集（步骤C4）。 />
使用 In-Vivo Xtreme II通过生物发光定量寄生虫负担寄生虫负担可以在寄生虫感染后立即确定，也可以在实验过程中确定。一次可以成像5只小鼠。
1. 启动 In-Vivo Xtreme II系统并设置生物发光协议。
  1. 打开设备。
  2. 启动计算机之前，请等待2分钟。
  3. 打开计算机电源后，访问MI软件并选择Capture Xtreme BI 4MP。
  4. 使相机达到-90°C的工作温度。准备使用相机时，“ CCD工作温度”框将从红色变为绿色。
    注意：此步骤的持续时间约为10分钟。
  5. 输入预定的捕获参数（表1）（请参见注释）：
    
    表1.捕获不同形式的值。形式： In-Vivo Xtreme II中可用的成像模式（荧光，发光，X射线和反射率）。曝光时间：相机收集光线的时间（秒，分钟）。模式：相机拍摄图像的方式。 kVp：施加在X射线管上的最大张力。合并：将图像传感器上相邻像素合并为一个“超级像素”的过程。 fSTOP：相机光圈的光圈。视野：视野。焦平面：焦点。
  6. 将步骤C1e中的参数另存为单独的会话文件。
  7. 通过从系统界面获取窗口选择创建/编辑协议按钮来创建协议。
  8. 选择先前的发光会话文件作为步骤C1。接下来，选择相应的X射线会话文件作为步骤C2。最后，如步骤C3所示，选择反射会话文件。在协议的三个步骤中，在“图像捕获器之前和之后” 中都保持“ 不执行任何操作”。
  9. 保存协议。
2. 向小鼠注射荧光素溶液（视频1，第2部分）
  1. 使用U-100胰岛素注射器以150 mg / kg /小鼠的最终剂量腹膜内注射200μl荧光素溶液（配方6）。
  2. 萤光素给药后等待10分钟，然后再开始获取图像。
    注意：荧光素注射过程中不对小鼠进行麻醉。在小鼠体内注射荧光素时，层流罩的灯关闭。
3. 在小鼠体内注射萤光素后6-7分钟，异氟烷麻醉并转移至SPFC室（视频1，第3、4、5和6部分）。
  1. 使用诱导室对小鼠麻醉重复步骤B。
  2. 将麻醉的小鼠转移到与异氟烷系统连接的SPFC室的各个鼻锥（图2A）。
4. 在向小鼠注射荧光素10分钟后，将SPFC腔室引入 In-Vivo Xtreme系统并进行图像采集（视频1，第6、7和8部分）。
  1. 打开连接到成像系统的异氟烷系统。
  2. 将SPFC腔室插入 In-Vivo Xtreme机器。
  3. 将所有异氟烷管道连接到SPFC（图2B）。
  4. 通过从主获取窗口界面单击 Execute Protocol 按钮执行先前保存的协议（步骤C1i）。在执行协议期间，请注意一个状态窗口，其中提供了有关当前捕获，曝光持续时间以及协议步骤的实时报告。
  5. 捕获图像后，从成像系统中取出SPFC腔室并关闭异氟烷系统。
  6. 将麻醉的小鼠转移到笼子里，并监视动物，直到它们完全康复为止。
  7. 在MI软件中打开获取的图像以进行视觉检查和感兴趣区域（ROI）分析。
    
    图2. SPFC腔室。 A. SPFC腔室连接到异氟烷系统上，用于引入麻醉小鼠。 B. Xtreme II系统的SPFC腔室连接到异氟烷系统。

数据分析

图像叠加
发光图像叠加可以使用X射线或反射图像执行。
使用发光和X射线图像的示例：
1. 使用MI软件打开发光（前景）图像（图3A）。
2. 通过单击顶部栏上的图像显示选项卡并设置 Min / Max 值，删除发光图像的背景（图3B）。
  注意：最小/最大范围因研究而异，具体取决于捕获的发光强度。图像应与显示特定信号的最小值/最大值进行对比，避免任何非特定背景信号。
3. 转换为Photons / s / mm 2 （图3C）。
4. 使用MI软件打开X射线（背景）图像（图3D）。
5. 从图像显示选项卡中单击覆盖选项，选择“发光”图像，然后选择透明度选项（图3E）。
6. 要提取叠加的图像，请从导航菜单中选择 Annotations 选项（图3F）。将任何其他数据或对象添加到叠加层。包含所有注释后，从 Edit 顶部标签中选择全选选项。将叠加的图像复制并粘贴到所需的文件（例如，Word，PowerPoint，Photoshop）中以进行显示。
图像分析
发光强度定量。一次可以分析5只小鼠。
1. 从“图像叠加”部分重复步骤1-4。
2. 从 Navigation 面板中打开 Manual ROIs 标签，然后单击 New ROI 集（图3F）。
3. 创建一个ROI集并对其进行调整以更好地封装检测到的发光强度（图3G）。
  注意：可以将ROI集保存为模板，以便使用相同的实验布局进行以下图像分析。
4. 要查看定量结果，请从顶部菜单栏中选择 Analysis 标签，然后选择 Display 标签（图3H）。
5. 从显示选项中，选择所需的参数，然后单击“确定”。
6. 复制获得的结果并将其粘贴到适当的文件中以进行进一步分析（例如，，Word，Excel，GraphPad Prism）。例如，将“分析”选项卡中的“求和”值（图3H）复制到GraphPad Prism软件。将数据表示为平均值和？SD或SEM（图3I）。
7. 保存图像，以便进行ROI分析。
在 Lgy 整个感染过程中寄生虫发光的测量（图3J）可以研究疾病的进展。在 Lgy 感染的情况下，足垫肿胀的高峰出现在感染后4周，感染后8周才消退（Ives et al。，2011； Hartley et al。，2016）。这些结果在图3J中观察到，寄生虫负担在感染后4周达到峰值，并且在感染后8周急剧减少。

图3.皮下接种10 6 荧光素酶转染的Lgy后监测脚垫中生物发光活性的水平：图像叠加层和图像分析。 AC。逐步分析，从发光捕获中移除背景，并将强度转换为光子/秒/毫米 2 。 D. X射线捕获的示例。 E. C + D图像的叠加。 F.导航显示。 G.用一组ROI覆盖。 H.从“分析”选项卡获得的定量结果。 I.使用GraphPad Prism软件在感染后4周（H Sum柱，光子/秒）感染 Lgy 小鼠脚垫的寄生虫负担。 J.来自 Lgy 感染的小鼠脚垫的寄生虫负担动力学（总和，光子/秒）。我数据代表5只小鼠的平均值和ΔSEM。

笔记

捕获参数是在布鲁克公司（BRUKER）的帮助下预先确定的。
发光方式：在我们的实验模型中，发光信号较低。我们使用5分钟的暴露时间来增加信号检测，但同时也要考虑将小鼠的麻醉降至最低。高灵敏度模式，以减少背景并增加发光信号的灵敏度。 4x4像素合并可增加信号强度，但是否降低图像分辨率则无关紧要。大孔径（fSTOP 1.1）有助于改善对弱信号（例如发光）的检测。 FOV 19允许对5只小鼠/捕获进行成像。
X射线和反射模式：由于信号较强，因此曝光时间以秒为单位，处于高速模式。合并1x1（无合并）和fSTOP 4分别提高图像的分辨率和景深。 45 kVp用于X射线捕获，因为它可以实现更好的体内骨分辨率。

菜谱

完整的寄生虫培养基
500毫升施耐德的果蝇培养基
100 ml热灭活的FBS（配方2）
5毫升HEPES
5毫升P / S
250μl生物蝶呤（配方3）
1毫升Hemin叶酸（配方4）
使用Vacuum Filtration 500-Filtermax过滤所有试剂，分装并保存在4°C
热灭活的FBS
在RT上解冻FBS。然后，通过将FBS在56°C的水浴中孵育30分钟来进行热灭活。分装并储存在-20°C
生物蝶呤
在DMSO中将生物蝶呤重构为1.2 mg / ml的浓度。分装并储存在-20°C
叶绿素
将100 g血红素和200 g叶酸溶于20 ml 0.1 M NaOH中
加入40毫升H 2 O
将pH值调整为8
高压灭菌器
分装并储存在4°C
寄生虫固定液
48毫升DPBS
2毫升戊二醛溶液技术
储存在4°C
萤光素溶液
66.6毫升DPBS
1克VivoGlo TM 荧光素
在DPBS中将萤光素重构为15 mg / ml的浓度。使用孔径为0.22μm的过滤器和50 ml注射器过滤溶液。等分试样并储存在-20°C。等分试样在注入前于RT解冻

致谢

感谢Slavica Masina对手稿的严格阅读和Tiia Sn？k？获得视频准备方面的帮助。这项研究得到NF的FNS赠款310030_173180和IZRJZ3_164176 / 1以及NF的aIRR的支持。该协议改编自Ives等人（2011）和Hartley等人（2018）中描述的协议。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

本出版物中的所有动物规程均已获得瑞士联邦兽医局（SFVO）的批准，批准号为2113。严格按照SFVO制定的道德准则并经过安全部门的检查，进行动物处理和实验程序瑞士沃州的环境与环境。

参考文献

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