材料和试剂

盖玻片（Thermo Scientific，Menzel，货号：1011880500）
显微镜载玻片（R.Langenbrinck，目录号：03-0003）
石蜡
50毫升猎鹰管
小鼠（任何小鼠品系的产后和成年大脑都适合于Gallyas染色）
2-丙醇（Roth，目录号：6752.4）
醋酸（Merck Millipore，目录号：1000631000）
乙酸酐（Acros Organics，目录号：149490010）
硝酸铵（Merck Millipore，目录号：1011880500）
乙醇（Roth，目录号：9065.4）
Eukitt（O. Kindler，目录号：4023.1），在室温下存放
甲醛37％（Roth，目录号：P733.1）
氯化钾
KH 2 PO 4
氯化钠
NaH 2 PO 4
硝酸（Roth，货号：2616.2）
多聚甲醛（Serva，目录号：31628.02）
吡啶（AppliChem，目录号：A0776.0500）
硝酸银（MerckMillipore，目录号：1015120025）
无水碳酸钠（MerckMillipore，目录号：1063920500）
氢氧化钠（MerckMillipore，目录号：1064981000）
五水合硫代硫酸钠（J.T. Baker，目录号：3946-01）
蔗糖（Sigma-Aldrich，目录号：S9378-5KG）
钨硅酸水合物（MerckMillipore，目录号：1006590025）
二甲苯（Otto Fischar，目录号：27404）
10x PBS储备溶液（请参阅食谱）
组织的PFA为4％（请参阅食谱）
孵育溶液（请参阅食谱）
物理显影解决方案（请参阅食谱）
1. 解决方案A
2. 解决方案B
3. 解决方案C

设备

过滤器单元（Corning，目录号：431153）
通风柜（Dueperthal，型号：Typ 90）
玻璃器皿（带有玻璃盖的矩形染色皿，可移动的玻璃滑架，尺寸：91 mm x 71 mm x 60 mm，由例如出售，VWR）
显微镜（蔡司，型号：Axiophot）
切片机（ThermoFisher Scientific，型号：HM 430）
石蜡包埋机（微米，型号：HMP110）

程序

石蜡包埋和切片机切片＆nbsp;
1. 小心地移开大脑或脊髓，并在4％PFA中将其后固定在组织中一小时，直到在4°C的50 ml Falcon中过夜。
  注意：在将石蜡包埋到大脑之前，先对小鼠进行心内灌注。
2. 使用自动嵌入机将大脑嵌入石蜡中，以获得最佳效果。
3. 使用嵌入机的推荐协议。如果不建议使用特定协议，请使用以下协议：
  class =“ ke-zeroborder” bordercolor =“＃000000” style =“ width：50％;” border =“ 0” cellspacing =“ 0” cellpadding =“ 2”> <身体>试剂
  持续时间
  50％乙醇
  1小时
  70％乙醇
  2x 2小时
  96％乙醇
  2x 1小时
  100％乙醇
  2x 1小时
  2-丙醇
  1小时
  二甲苯
  2x 2小时
  石蜡
  2x 2小时
4. 使用切片机切割5μm切片，并将切片安装在显微镜载玻片上。在室温下风干（RT）。存放在室温下以备将来使用。
  注意：对于后续的光学显微镜，5μm的厚度是最佳的。安装在幻灯片上对于部分的完整性最为保守。
Gallyas银浸渍法（方案概述，见图1）
1. 分别在二甲苯，二甲苯和2-丙醇/二甲苯（1：1）中孵育10分钟，以去除石蜡切片。然后将切片分别在100％，90％，70％，50％的乙醇和蒸馏水（dH 2 O）中孵育5分钟。
  注意：福尔马林固定切片也适用于随后的Gallyas银染色，如Pistorio等人（2005年）所述。但是，石蜡切片中的形态保持性优于冷冻切片。
2. 为了抑制非髓磷脂组织的染色，将切片在吡啶/乙酸酐（2：1，例如，200 ml吡啶和100 ml乙酸酐）中于室温（RT）孵育30分钟。
  注意：重新准备溶液，存储的溶液将变成黄色，需要丢弃。
3. 用dH 2 O洗涤3次，每次10分钟。
4. 将切片浸入培养液中，在440 W下微波加热2分钟。培养液不得沸腾。温度应达到约50°C。让其在室温下冷却10分钟，直到变冷为止。
5. 用0.5％的乙酸洗涤切片3次，每次5分钟。
6. 在物理开发解决方案中开发部分3-15分钟。 1-2分钟后，通过将切片置于1％乙酸中开始监视显微镜下的反应（=中断反应的进行）。要确定染色是否已达到所需的强度，请与图2所示的最佳结果进行比较。髓磷脂的颜色应为深棕色，并且与背景相比应显示出良好的对比度。如果太白，可以将切片再次暴露于物理显影液。重复直到达到最佳结果。
7. 通过将切片在1％乙酸中孵育3次，每次5分钟来终止染色反应。
8. 在dH 2 O中洗涤两次，每次3分钟。
9. 在2％的硫代硫酸钠中孵育切片5分钟以固定污渍。
10. 用dH 2 O洗涤两次，每次5分钟。
11. 每5分钟在50％，70％，90％，100％乙醇中脱水，然后在2-丙醇/二甲苯（1：1），二甲苯和二甲苯中分别脱水10分钟。
12. 用Eukitt和盖玻片安装部分。
  注意：在RT的幻灯片框中存储的切片的保存期限为多年。
13. 结果：髓磷脂和红细胞被染成黑色，有时核也被染上，背景是浅黄色（图2）。
  
  图1.流程图，描述了脱蜡，染色，补水和安装程序的各个步骤和时间规格
显微镜
可以使用光学显微镜以不同的倍率获取图像（图2）。

图2.小鼠大脑的Gallyas银浸渍。接受此处所述的Gallyas方案的3个月大的小鼠大脑的矢状面视图。描述了大脑的不同区域：海马A.皮层B.小脑C.纹状体D.纹状体E.中脑。 CC = call体，CI =囊状内膜，CP =刺参。比例尺= 100μm。

数据分析

浸有银的大脑切片的图像可以用作代表图像，也可以用来比较实验条件，小鼠品系等的髓鞘形成的总体形态差异。

笔记

除了使用水进行清洗的步骤和安装部分以外，还请在化学通风橱中执行该步骤。
将用于银染的玻璃器皿用1％硝酸洗涤过夜，然后用水冲洗。
请勿使用小铲，镊子 etc 等金属物体。
请勿使用金属刮刀称重硝酸银。
丢弃危险废物容器中的含银试剂。

菜谱

致谢1。 10倍PBS储液
class =“ ke-zeroborder” bordercolor =“＃000000” style =“ width：40％;” border =“ 0” cellspacing =“ 0” cellpadding =“ 2”> <身体>氯化钠
80克
氯化钾
2克
NaH _{2 PO _{4
14.1克
KH _{2 PO _{4
2克
溶于1000 ml dH 2 O，并用NaOH调节pH到7.3。存放在RT。要制备1x PBS，请用dH 2 O稀释}}}}
4％PFA用于组织
class =“ ke-zeroborder” bordercolor =“＃000000” style =“ width：30％;” border =“ 0” cellspacing =“ 0” cellpadding =“ 2”> <身体>多聚甲醛
4克
蔗糖
4克溶于100 ml PBS。可以储存在-80°C
孵化液
class =“ ke-zeroborder” bordercolor =“＃000000” style =“ width：30％;” border =“ 0” cellspacing =“ 0” cellpadding =“ 0”> <身体>硝酸铵
1克
硝酸银
1克
溶于1000 ml dH 2 O
用NaOH将pH调节至7.4-7.6
摇动后褐色沉淀将消失。可以在4°C下保存8-10周。
物理显影液
解决方案A
无水碳酸钠＆nbsp; ＆nbsp; ＆nbsp; 50克
溶于1000 ml dH 2 O。可以在准备工作之前进行准备，并在4°C下保存数周
解决方案B
class =“ ke-zeroborder” bordercolor =“＃000000” style =“ width：30％;” border =“ 0” cellspacing =“ 0” cellpadding =“ 0”> <身体>硝酸铵
2克
硝酸银
2克
钨硅酸水合物
10克
溶于1000 ml dH 2 O。可以在准备工作之前进行准备，并在4°C下保存数周。
解决方案C
class =“ ke-zeroborder” bordercolor =“＃000000” style =“ width：610.4px;” border =“ 0” cellspacing =“ 0” cellpadding =“ 0”> <身体>硝酸铵
2克
硝酸银
2克
钨硅酸水合物
10克
甲醛（37％）
7毫升
溶于1,000 ml dH 2 O。可以在准备工作之前进行准备，并在4°C下保存数周
最终的身体发育解决方案
50％溶液A（100毫升）+ 35％溶液B（70毫升）+ 15％溶液C（30毫升）
始终准备新鲜。不要存放

致谢

这项工作得到了Deutsche Forschungsgemeinschaft（DFG，授权STE1117 / 11-1）的支持。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

LANUV（Nordrhein-Westfalen，84-02.04.2015.A529）批准使用动物。

参考文献

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