材料和试剂

5 ml注射器（BD Plastipak，目录号：307731）

10 ml注射器（BD Plastipak，目录号：307736）

巴斯德移液器（科学实验室用品，目录号：PIP4210）

50 ml猎鹰管（Sarstedt ，品牌，型号/目录编号：114 x 28 mm，62.547.004）

15 ml猎鹰管（Sarstedt ，品牌，型号/目录编号：120 x 17 mm，62.554.002）

无菌手术刀＃21刀片（Swann-Morton，目录号：0507）

聚苯乙烯细胞培养皿（Sarstedt ，目录号：83.3902）

注射器过滤装置Filtropur S 0.2（Sarstedt ，目录号：83.1826.001）

剪刀

胶原酶P从溶组织梭菌（默克，罗氏，目录号：11213857001）。用PBS稀释至150 U / ml，在-20°C下储存100μl 等分试样

TrypLE Express酶（无酚红； Thermo Fisher，目录号：12060413）。在室温下避光保存长达2年

胎牛血清（Biosera ，目录号：FB-1001 / 500）。储存在-20°C长达60个月

来自牛胰腺的脱氧核糖核酸酶I（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：D4263）。用1 ml PBS（2000 U / ml）稀释，在-20°C下储存40μl 等分试样

Dulbecco的改良Eagle培养基（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：D5671-500ML）。储存在4°C

L-谷氨酰胺（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：G7513-100ML）。储存于-20°C长达2年

青霉素-链霉素（Merck，Sigma-Aldrich，目录号：P4333-100ML）。储存于-20°C长达2年

磷酸盐缓冲盐水（PBS）

两性霉素B（250 微克/毫升; GIBCO，目录号：15290-018）。储存在-20°C一年

无菌双蒸H 2 O

红细胞裂解缓冲液（10倍; BioLegend公司，目录号：420301）。储存在4°C

DNase库存解决方案

“完成” DMEM（请参阅食谱）

“空” DMEM（请参阅食谱）

设备

轨道振动培养箱（ eg ，Grant-bio轨道振动培养箱ES-20）

EASYStrainer 40 微米（Grener 生物一个，目录号：542040）

离心机< BR />

程序

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组织解离 < ol class = “npwtwo ”>

样品收集< BR /> 将组织样品在冰上的“空” DMEM（配方2）中运输

准备工作解决方案 < ol class = “npwthree ”>

在50ml Falcon管中，加入100 微升胶原酶P和40 微升DNA酶储备溶液至5ml“完全” DMEM（配方1）

制作PBS-A：在15毫升Falcon 管中的10毫升PBS中加入1 微升两性霉素；

机械解离< BR /> 在聚苯乙烯培养皿中，将组织切开10-12次以放松组织

用PBS-A洗涤样品 < ol class = “npwthree ”>

在切开的组织中加入5 ml PBS-A，在室温下放置5分钟

如果样品特别拥塞，则可以重复此过程

酶解离 < ol class = “npwthree ”>

使用剪刀以45度角切割Pasteur移液器灯泡，以制作出勺子。用它来去除PBS-A中的组织

转移到装有胶原酶P / DNase溶液的50 ml Falcon管中

将50毫升Falcon管移至定轨振荡器上。

在搅拌（200 rpm）下于37°C孵育15分钟

15分钟后，从定轨摇床上取下，并依次用50 ml，10 ml和5 ml移液管吸头以促进解离

再返回摇床15分钟，然后重复顺序移液

再返回轨道振荡器30分钟，然后重复顺序移液

胰蛋白酶治疗 < ol class = “npwthree ”>

将样品以450 x g 离心5分钟

除去上清液，然后将得到的沉淀重悬于1 ml未稀释的TrypLE中。

在37°C下孵育10分钟

去除未消化的组织碎片 < ol class = “npwthree ”>

将组织过滤器添加到冰上新的50毫升Falcon管中。

应变组织/酶悬液，用5 ml注射器的柱塞压入，同时用“空” DMEM洗涤

从此将样品放在冰上

红细胞溶解 < ol class = “npwthree ”>

在4°C下以450 x g 离心样品5分钟

吸出培养基

将沉淀重新悬浮在1 ml红细胞裂解液中

在4°C下孵育10分钟

在4°C下以450 x g 离心5分钟

样品收集

吸出红细胞裂解缓冲液

将沉淀重悬于1 ml“完整” DMEM中

将细胞现在准备进行定量（如有必要）和使用

笔记

1. 单细胞悬液可用于许多下游应用，包括单细胞RNA测序，建立原代成纤维细胞培养物和分离成纤维细胞亚群。对于使用Drop-seq平台进行单细胞RNA测序，将细胞重悬于二次蒸馏过的H 2 O中，再补充9％Optiprep （Sigma-Aldrich），1％PBS和0.1％BSA ，并按照Macosko et al。（2015）进行的修改如下：PCR时为500 ng cDNA，PCR循环为15个。可行使用的细胞数量将取决于微流步骤的产量。

要建立原代细胞培养，将1 x 10 5 个细胞/ cm 2 铺板到”Complete” DMEM中的组织培养板上。在加湿的培养箱中于37 ° C和5％CO 2 中孵育2 小时以使细胞粘附，然后用PBS洗涤3次以除去未粘附的细胞。根据流式细胞仪分析，这通常可产生99.1％的纯成纤维细胞（CD45-EpCAM-CD31-CD90 + ）培养物。但是，用户应注意，这些培养条件不会维持体内成纤维细胞表型（Waise et al。，2019）。

可以将针对特定成纤维细胞表面标记的抗体（例如，PDGFR-α[ Erez et al。，2010]）与荧光激活或磁性细胞分选结合使用。用于分离成纤维细胞亚群。采用这些方法酶促解聚可改变表面标志的表达（灰色<时，它是音符的EM 。>等人，2002 EM >等人，2011; Quatromoni 等等人，，2015），并且没有一个单一的表面标记能够可靠地识别或区分所有成纤维细胞群（Sugimoto 等人，，2006；Lambrechts 等人。，2018）。

< BR />

菜谱

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“完成” DMEM < BR /> Dulbecco氏改良Eagle培养基（西格玛Aldrich）的< BR /> 10％（V / V）胎牛血清（Biosera ）< BR /> 1％（V / V）L-谷氨酰胺（西格玛Aldrich）的< BR /> 1％（v / v）青霉素链霉素（Sigma-Aldrich）

“空” DMEM < BR /> Dulbecco氏改良Eagle培养基（Sigma-Aldrich公司）仅< BR />

致谢

该方案源自先前公布的数据28。这项工作得到英国癌症研究和医学研究理事会临床研究培训奖学金以及病理学会实习生向西南小额资助的支持。Drop-seq的实施得到了医学研究理事会发现奖（MC_PC_15078）和MJJRZ，CHO，JW，CJH＆amp; amp; amp; amp; amp; amp;＃39 GJT。RP由授予MJJRZ 的约翰·高盛未来科学奖学金（2016 / JGF / 0003; Leuka Charity）支持。作者感谢Evan Macosko ，Melissa Goldman和Steve McCarroll 的有用建议，Serena Chee博士（南安普敦大学医院），Benjamin Johnson，Carine Fixmer 和Maria Lane（TargetLung 临床试验协会）为我们提供了获取临床样品的途径，并感谢患者参与了这项研究。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

从南安普敦综合医院接受手术的患者那里新鲜采集肺样品（TargetLung 研究；已由NRES委员会中南部批准：汉普郡A，REC号14 / SC / 0186）。所有研究均按照适当的规定进行。获得患者或其法定监护人的知情同意。

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