材料和试剂

注意：所有试剂应为分子生物学级，以避免污染核糖核酸酶。

聚苯乙烯微量滴定板（MICROLON，96孔单断裂条板，PS）（Greiner Bio-One，目录号：705071）
PCR试管（终点PCR试管; TreffLab实验室耗材，目录号：96.09852.9.01，qPCR试管; SSIBio，目录号：3248-00）
cnvK-rG嘌呤霉素连接子，储存在-20°C
注：cnvK-rG嘌呤霉素连接子的成分可从定制DNA合成服务获得。请参阅（Nemoto et al。，2018或Terai et al。，2019）了解详细的形成方案。
DNA寡核苷酸可从定制DNA合成服务获得。Eurofins基因组学（日本东京大田区），筑波Oligo服务中心（日本茨城县土浦市）和北海道系统科学公司（日本北海道札幌市）在-20°C下存储
无核酸酶的超纯蒸馏水（UPDW）（各种供应商）
PrimeSTAR HS DNA聚合酶（Takara，货号：R010A），储存在-20°C
FavorPrep PCR Clean-Up Mini Kit（Favorgen），在室温下保存
RiboMAX TM 大型RNA生产系统T7（Promega，货号：P1300），储存在-20°C
RNA纯化试剂盒（Favorgen，目录号：FAPCK001），储存在4°C
核酸酶处理的兔网织红细胞裂解液系统（Promega，目录号：L4960）。包括用于翻译的氨基酸混合物。储存在-80°C
RNasin ®核糖核酸酶抑制剂（Promega;目录号：N2111），储存在-20°C
Dynabeads MyOne链霉亲和素C1（VERITAS;目录号：DB65002），在4°C下储存
ReverTra Ace ®（Toyobo，目录号：TRT-101）。包括5x RT缓冲液和每个dNTP混合物2.5 mM。储存在-20°C
他的Mag Sepharose Ni（GE Healthcare，目录号：2896390）
RNase T1（1,000 U / L）（Thermo Fisher Scientific，目录号：EN0541）
RNase H（Takara，货号：2150A，10 U）和10x NE缓冲区2（NEB）
DL-二硫苏糖醇≥99.0％（RT）（Sigma，目录号：4381）
快速装载100 bp DNA梯子（Biolabs，目录号：N0467），NEB
SYBR TM 金核酸凝胶菌株（Invitrogen，目录号：S11494）
THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix（Toyobo，货号：QPS-201）
10x PBS（磷酸盐缓冲盐水）（Wako，目录号163-25265）
抗GFP（绿色荧光蛋白）pAb（MBL Life Science，目录号：598）
脱脂牛奶（和光，目录号：190-12865）
氯化钠（和光，目录号：191-01665）
Tris-HCl（和光，目录号：208-14691）
KCl（和光，目录号：163-03545）
MgCl 2 （和光，目录号：136-03995）
EDTA（Invitrogen，货号：15575-038）
尿素（和光市，商品目录号：217-01215）
溴酚蓝（BPB）（和光，目录号：021-02911）
二甲苯基丙醇（XC）（和光，目录号：244-00461）
蔗糖（和光，目录号：196-00015）
UltraPure不含DNase / RNase的蒸馏水（UPDW）（Invitrogen，目录号：10977-015）
过硫酸铵（和光，目录号：012-20503）
丙烯酰胺（Nacalai Tesque，目录号：00807-05）
四甲基乙二胺（TEMED）（和光，目录号205-06313）
硼酸（和光，目录号：021-02195）
Tween20（Sigma-Aldrich，目录号：P9416）
磷酸氢二钠（和光，目录号：042-29445）
咪唑（和光，目录号：095-05392）
甘氨酸（和光，目录号：077-00735）
盐酸（HCl）（Sigma-Aldrich，目录号：320331）
Tris-borate-EDTA（TBE）缓冲液（10x）（Invitrogen，目录号：B52）
Tris-EDTA（TE）缓冲器（Invitrogen，目录号：AM9849）
Tris base（和光市，商品目录号：011-20095）
SDS（和光，目录号：194-13985）
APS（和光，货号：016-08021）
BIS（N，N'-亚甲基双（丙烯酰胺）（和光，目录号：130-06031）
1x SYBR金核酸凝胶菌株（储存在4°C，请参见食谱）＆nbsp;
2x加载染料（请参阅配方）
4 ml变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）10 ml（请参见配方）
5x TBE缓冲液1 L（请参阅配方）
2个绑定缓冲区（请参阅食谱）
Ni-NTA结合/清洗缓冲液（请参见配方）
Ni-NTA洗脱缓冲液（请参见配方）
SDS页胶（准备并在实验前2至3小时放置）（请参阅食谱）
10 ml的6％分离胶和5 ml的4％堆积胶
0.2 M甘氨酸-HCl缓冲液（请参阅食谱）
40％（w / v）丙烯酰胺（请参阅食谱）

设备

热循环仪（Biometra，型号：TRIO48）
生物分子成像仪（GE Healthcare，型号：Typhoon FLA9500）
NanoDrop分光光度计（Thermo Fisher Scientific，型号：1000 V3.3）
NanoDrop分光光度计（Thermo Fisher Scientific，型号：3300 V2.7，FITC）
加热块（ANATECH，型号：cool stat 5200）
紫外线交联剂（UVP，型号：CL-1000）
涡旋混合器（IWAKI，型号TM 2000）
磁选机（Invitrogen，型号：12320D）
热块旋转器（NISSIN，型号：SNP 24B）
StepOne实时PCR系统（Thermo Fisher Scientific，型号：4376600）
高速冷冻微量离心机（Tomy Tech，型号：KITMAN MX-301）
凝胶电泳仪（PAGE / SDS-PAGE）（ATTO，型号AE 6510）
移液器（Gilson Pipetman，型号P2- P1000）

软件

数量一维一维分析软件（Bio-Rad，版本4.6.6）
Primer Express（Thermo Fisher Scientific版本3.01）

程序

cnvK-rG嘌呤霉素连接子的合成（图2）
有关cnvK-rG puromycin-linker形成的详细方法，请参阅（Nemoto 等人，，2018或Terai 等人，，2019）。

图2.嘌呤霉素接头DNA示意图。嘌呤霉素接头DNA包括四个部分：mRNA的光交联位点（cnvK），逆转录的引物区，生物素部分。固定在SA珠上进行纯化，并有一个限制性位点从SA珠上释放。另外，该接头具有嘌呤霉素部分和FITC部分用于检测。

抗GFP VHH DNA模板的构建及其PCR扩增

如下制备抗GFP VHH编码DNA构建体。如果要使用其他VHH，请更改“ Anti-GFP VHH”部分。该DNA构建体可以作为人工基因化学合成在质粒上，也可以由几个片段进行重叠延伸PCR。请确保在cnvK NewYtag区域之前没有终止密码。

14-33	T7
34-36	5′顶盖
37-107	Ω
110-114	kozak
118-498	抗GFP VHH
499-522	GGGSGGGS
523-540	他的标签
541-549	GGS
550-571	cnvK NewYtag

GATCCCGCGAAAT TAATACGACTCACTATAGGG GAA GTATTTTTACAACAATTACCAACAACAACAACAAACAACAACAACATTACATTTTACATTCTACA /> ACTACAA GCCACC ATG GCCCAGGTGCAGCTGGTTGAAAGCGGTGGCCGTCTGGTGCAGGCGGGTGATAGCCTGCGTCTGAGCTGTGCCGCAAGCG
GTCGCACCTTTAGCACCAGCGCCATGGCATGGTTTCGTCAGGCCCCGGGCCGTGAACGCGAATTTGTGGCGGCCATTACCTGGACCGTTGGTAACAC
CATCCTGGGCGATAGCGTGAAAGGTCGTTTTACCATTAGCCGTGATCGCGCCAAAAACACCGTGGATCTGCAGATGGATAATCTGGAACCGGAAGATA
CCGCGGTTTATTATTGTAGCGCCCGTAGCCGCGGTTATGTGCTGAGCGTTCTGCGCAGCGTTGATAGCTATGATTATTGGGGTCAGGGCACCCAGGTT
ACGGTCAGC GGCGGCGGCTCGGGCGGCGGGGTTCC CATCATCATCATCATCAT GGCGGAAGC AGGACGGGGGGGGCGGCG T GGAAA

进行PCR扩增以产生适当的DNA浓度，如下所示：混合2 µl DNA样品（〜50 ng），1 µl 10 µM正向引物，1 µl 10 µM反向引物，4 µl 2.5 mM dNTP Mix，10 µl在PCR试管中，使用5x PrimeSTAR缓冲液（Mg 2 + ），0.5 µl PrimeSTAR HS DNA聚合酶（2.5 U / µl）和UPDW至50 µl。
PCR程序如下：98°C 1分钟，98°C 10 s，64°C 5 s，72°C 37 s（延长时间取决于DNA长度），重复这些循环25个循环三个步骤，然后在72°C下放置2分钟。正向引物：5'-GATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGG-3'，反向引物：5'-TTTCCACGCCGCCCCCCCCGTCCT-3'。
如下使用凝胶成像仪分析4％变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）上的DNA扩增。
注意：确保扩增过程中没有子带，如果是，则调整PCR周期或切割正确的凝胶带并纯化DNA。
混合0.5 µl DNA样品，1.5 µl UPDW和2 µl 2x上样缓冲液。使用100 bp DNA梯子作为标记（配方1）。
在上样之前，通过在85°C下加热5分钟使DNA变性。
使用含有8 M尿素（配方2）和0.5x TBE作为运行缓冲液（配方3）的凝胶（厚度为1 mm）在60°C，200 V下进行PAGE分析20分钟。
使用FavorPrep DNA纯化试剂盒纯化DNA。使用UPDW作为洗脱液。
使用NanoDrop测量DNA浓度。

cDNA展示分子的合成
1. 体外转录
  1. 如下准备转录反应溶液：混合4 µl 5x T7转录缓冲液，6 µl 25 mM每个rNTP混合物[混合等体积的四个单独的100 mM rNTP（rATP，rCTP，rGTP和rUTP）]，200 ng模板DNA，2 µl T7酶混合物，并加入无核酸酶的水至20 µl。
  2. 在加热块上于37°C孵育2-4小时。
    注意：mRNA的量取决于孵育时间。
  3. 加入2 µl无RQ-1 RNase的DNase，并在加热块上于37°C孵育15分钟。
  4. 使用RNA Clean-Up试剂盒纯化转录本（mRNA）。
  5. 使用NanoDrop通过在260 nm处的吸光度确定其浓度。
    注意：mRNA的浓度应超过2 pmol / µl，260/280 nm的比率应超过1.8。
  6. 将mRNA储存在-80°C直至使用。
2. mRNA与cnvK-rG嘌呤霉素连接子之间的光交联
  1. 如下制备光交联反应溶液：混合4 µl的1 M NaCl，4 µl的0.25 M Tris-HCl（pH 7.5），20 pmol的cnvK-rG嘌呤霉素连接剂，20 pmol的mRNA和无核酸酶水高达20 µl。
    注意：方便地制备1 pmol / µl的连接产物（mRNA-puromycin-linker）的工作溶液。
  2. 在90°C下孵育1分钟，然后以0.4°C / s的速率将温度降低至70°C，并孵育1分钟，然后使用热循环仪。
  3. 使用紫外线交联剂在365 nm的紫外线下（在同一管中）照射约30 s。
  4. 与步骤B中所述相同，准备用于凝胶电泳的样品。
  5. 在包含8 M尿素的4％变性PAGE上分析光致交联产物，并使用荧光凝胶成像仪（数据分析A）可视化嘌呤霉素接头中的FITC基序。
    注意：结合效率可以通过分析结合的和未结合的嘌呤霉素接头的FITC谱带强度比来估算。
    之后，用SYBR Gold（配方9）将同一凝胶染色约1分钟，用水洗涤，然后拍照。
  6. 使用前，将连接的样品保存在-80°C下。分别保存0.5 µl样品，用于后续的SDS-PAGE分析（步骤D）。
3. 体外翻译（mRNA-VHH融合分子的合成）
  1. 如下准备翻译混合物：混合6 pmol / 6 µl光交联产物，35 µl兔网织红细胞裂解液，1 µl氨基酸翻译混合物，1 µl RNasin ®核糖核酸酶抑制剂和高达50 µl的无核酸酶水。
    注：由于mRNA-Puromycin-linker的工作溶液为1 pmol / µl，所以6 µl等于6 pmol。由于较高的翻译效率，反应体积应小于50 µl。如果需要扩大反应规模，请在多个试管中准备50 µl反应溶液。
  2. 将混合物在加热块上于30°C孵育20分钟。
  3. 向每个试管中加入24 µl 3 M KCl和6 µl 1 M MgCl 2 。在37°C下孵育60分钟。
  4. 加入18 µl 0.5 M EDTA和98 µl（相同体积的混合物）2x结合缓冲液（配方4）。在37°C下孵育5分钟。
  5. 将16.3 µl翻译反应样品收集到一个单独的试管中，用于随后的SDS-PAGE分析（步骤D）。
4. mRNA-VHH融合分子在链霉亲和素磁珠上的固定
  1. 取链霉亲和素（SA）磁珠的10μl悬浮液用于1 pmol的光交联产物（ ie ，60μl表示6 pmol），并用200μl1x结合缓冲液洗涤磁珠两次。 br /> 注意：所有洗涤步骤均应在室温下进行。
  2. 将珠子与其余的翻译反应样品重悬。
    注意：如果反应体积对于一根试管来说太大，请使用几支带有珠子的试管。在移液珠子过程中没有必要修剪尖端。
  3. 将混合物在热块旋转器中于25°C孵育30分钟。
    注意：在孵育过程中，应使珠子保持悬浮状态，以避免珠子聚集。
  4. 将试管放在磁力分离器上1分钟，然后将16.3 µl的上清液收集到另一个试管中，用于随后的SDS-PAGE分析（步骤D）。
  5. 丢弃剩余的上清液，并用200 µl 1x结合缓冲液洗涤磁珠3次。
5. 反转录形成cDNA展示分子。
  1. 用100 µl 1x RT Buffer洗涤固定在SA磁珠上的mRNA-VHH融合分子（根据上述步骤）。
  2. 如下制备用于60 µl SA珠的逆转录（RT）反应溶液：混合10 µl 5x RT缓冲液，25 µl 2 mM dNTP混合物，14 µl无核酸酶的水和1 µl ReverTra Ace ®（100 U / µl）。
  3. 将SA珠重悬于RT反应溶液中，并使用热块旋转器在42°C下孵育30分钟。
    注意：在孵育过程中，应使珠子保持悬浮状态，以避免珠子聚集。
  4. 将试管放在磁力分离器上1分钟，弃去上清液，用200 µl 1x结合缓冲液洗涤两次，再用100 µl 1x Ni-NTA结合/洗涤缓冲液洗涤一次（配方5）。
  5. 用29.8 µl 1x Ni-NTA结合/洗涤缓冲液重悬上述小珠，并添加0.2 µl RNase T1（1,000 U / µl）。使用旋转器在37°C下孵育15分钟。
    注意：在孵育过程中，应使珠子保持悬浮状态，以避免珠子聚集。
  6. 将试管放在磁力分离器上1分钟，收集含有cDNA展示分子的上清液。
  7. 保存2.7 µl等分试样用于SDS-PAGE分析（过程D）。
6. His-tag亲和纯化cDNA展示
  1. 将20微升His Mag Sepharose Ni珠子放入试管中，并用100微升1x Ni-NTA结合/洗涤缓冲液洗涤两次。
  2. 将小珠重悬于mRNA / cDNA-VHH融合分子溶液（RNase T1裂解的上清液）中，并使用旋转器在25°C下孵育120分钟。
    注意：根据孵育时间调整孵育温度，以防止DNA降解。
  3. 将试管放在磁力分离器上1分钟，然后将2.7 µl上清液收集到另一个试管中，以用于随后的SDS-PAGE分析（步骤D）。
  4. 丢弃剩余的上清液，并用100 µl 1x Ni-NTA结合/洗涤缓冲液洗涤小珠两次。
  5. 将小珠重悬于25 µl Ni-NTA洗脱缓冲液（配方6）中，并使用旋转器在25°C下孵育20分钟。
    注意：洗脱体积可以根据需要进行调整，经过适当稀释后可以用于免疫测定。
  6. 将试管放在磁力分离器上1分钟，并收集含有纯化的cDNA展示分子的上清液。
  7. 保留2.5 µl等分试样用于SDS-PAGE分析（步骤D）。

通过SDS-PAGE确认cDNA展示物的形成

在上述过程中（过程C）收集的等分试样各相当于0.5 pmol分子。

（1）mRNA-Puromycin接头	0.5 µl
（2）输入（翻译后的mRNA-VHH融合分子）	16.3 µl
（3）SA磁珠固定化的上清液	16.3 µl
（4）洗脱RNase T1处理（粗略的cDNA显示）	2.7微升
（5）固定化镍珠的上清液	2.7微升
（6）Ni-NTA洗脱（纯化的cDNA展示）	2.5微升

将样品（4），（5）和（6）与0.2 µl RNase H，1 µl 10x NE缓冲液2和无核酸酶的水（将最终体积调节至10 µl）在37°C下孵育30分钟，以消化样品。 RNA / cDNA双链体。
对于样品（1），添加1.5 µl UPDW和2 µl 2x SDS样品缓冲液
对于RNase H孵育后的样品（4），（5）和（6），添加10 µl 2x SDS样品缓冲液。
对于样品（2）和（3），添加16.3 µl 2x SDS样品缓冲液。
在加载到凝胶上之前，将所有样品在热块中于95°C孵育5分钟。
在含有8 M尿素的SDS-PAGE中分析样品（4％堆积-6％分离凝胶，0.02 A，2 h），并使用荧光扫描仪可视化嘌呤霉素接头中的FITC基序（配方7）。
计算（1）和（6）的谱带强度比，以估算cDNA显示形成效率（数据分析B）。

夹层cD-IPCR用于靶蛋白（sfGFP）检测
1. 在聚苯乙烯微量滴定板上涂100 µl抗GFP pAb [PBS中的抗GFP pAb（稀释度= 1：450）]，并在4°C下保持过夜。
2. 每次用200 µl PBS洗涤板3次。
3. 加入200μl含PBS（w / v）的1％脱脂奶，并在25°C下孵育2小时以封闭孔。
4. 用200 µl PBS冲洗板。
5. 准备PBS蛋白中GFP蛋白的10倍系列稀释液，浓度从100 µg / ml到1 ng / ml以及阴性对照（无GFP）。建议所有样品应重复三次制备。
  注意：在这项研究中，我们使用了超级文件夹GFP（sfGFP）作为靶蛋白。蛋白质的氨基酸序列以及表达和纯化的方法在原始论文中有描述（Pédelacq等，2006）。
6. 向孔中加入100 µl每种GFP蛋白稀释液，并在25°C下孵育2 h。
7. 用200 µl PBS洗涤8次。
8. 用PBS-T缓冲液将编码抗GFP VHH的cDNA展示液稀释至65倍（如步骤C中所述）。
  注意：稀释率值应根据目标进行更改和凭经验确定。
9. 向孔中加入100 µl cDNA展示液（相当于〜1.3 fmol /样品），并在25°C下孵育2 h。
  注意：孵育过程中无需摇动平板。
10. 用200 µl PBS-T洗涤8次。（0.05％Tween 20在PBS中）
11. 在25°C下用100 µl 0.2 M甘氨酸/ HCl缓冲液（pH 2.2）洗脱结合的cDNA展示液15分钟（配方8）。
12. 用20 µl 1 M Tris碱溶液中和洗脱的DNA，并使用Favorprep试剂盒纯化cDNA展示。
13. 使用2-8 µl纯化的cDNA展示作为以下qPCR的模板。
14. 执行qPCR。PCR的步骤程序如下：95°C 1分钟，然后进行40个循环，分别是95°C 15 s和66°C 30 s。正向引物：AACACCATCCTGGGCGATAG，反向引物：GTGTTTTTGGCGCGATCAC。PCR混合物的制备如下：10 µl 2x反应缓冲液（包括酶和dNTP），0.6 µl每种引物（10 µM），2 µl模板，0.4 µl参考染料（ROX）和6.4 µl水。
  注意：这些引物对抗GFP VHH具有特异性。因此，如果使用其他VHH或肽适体，请使用Primer Express 3.01等软件设计合适的引物组。
15. 进行qPCR时，使用抗GFP VHH DNA制备标准曲线（100 pM，1 pM，10 fM，100 aM），并包括仅引物对照以验证扩增质量。
16. 计算样品与不含GFP的阴性对照之间的Ct值差异（数据分析C）。

数据分析

mRNA和cnvK-rG嘌呤霉素连接子的光交联
1. 保存图像数据并使用Quantity One 1-D Analysis Software打开文件。光连接样品的PAGE凝胶的代表性图像如图3所示。
  注意：为了获得最佳的量化效果，数字图像不应过度曝光。
  
  图3.使用嘌呤霉素接头中的FITC图案（右）和SYBR Gold染色后（左）在变性PAGE上可视化光交联产物的结果
2. 确认连接的mRNA的位置（接头+ mRNA，它应出现在比完整的mRNA稍高的位置），并且在SYBR Gold染色凝胶中没有亚带。
3. 定量FITC成像凝胶中连接的mRNA和未结合的接头的条带强度。如果连接了超过80％的接头，请继续进行下一步（体外翻译）。如果不是，请更改mRNA和接头的化学计量（在1：2和2：1之间的范围内），然后再次进行光连接。
  注意：建议将80％以上的接头连接到mRNA，因为蛋白质翻译溶液中剩余的游离接头可能会导致cDNA展示效率低下。
cDNA展示的形成
1. 使用FITC过滤器组可视化SDS-PAGE的凝胶。保存数据并使用Quantity One 1-D Analysis Software打开文件。代表性图像显示在图4A中。请注意，它对应于不同模型蛋白的凝胶，因为抗GFP VHH的形成效率低且难以分析。
  注意：如果读者想查看抗GFP VHH的数据，请参阅Anzai等人，2019。
2. 使用软件计算凝胶中每个条带的条带强度百分比（带有适当的背景减法）。使用“体积矩形”功能指示感兴趣区域，并使用“体积分析报告”功能显示结果。由于所有样品都对应于相同的摩尔量，因此您可以直接比较谱带强度。为了更好地理解，图4B中给出了模型蛋白的条带强度。
  注意：“背景”是没有任何条带的自由凝胶空间。
3. cDNA展示的形成效率（即，即来自mRNA接头的cDNA展示的产量）是样品（1）和（6）之间的谱带强度比的百分比值。例如，当我们比较（1）mRNA-Puromycin接头（其强度占所有条带的65.55％）和（6）Ni-NTA洗脱（纯化的cDNA展示，5.15％）的强度时，可计算出cDNA展示形成效率为是7.85％。通常，小多肽的cDNA展示的形成效率约为5-25％。
  
  图4.确认VHH的cDNA显示。 A.使用FITC过滤器设置的SDS-PAGE凝胶图像示例。较高的带负责正确形成的cDNA展示。注意，较低的带对应于未与肽缀合的mRNA接头。红色矩形表示用于强度计算的ROI。B.根据图4A的数据计算的相应的带强度。（1）mRNA-嘌呤霉素接头（65.55％），（2）输入（翻译后的mRNA-VHH融合分子）（21.88％），（3）SA-珠固定化的上清液（2.59％），（4）RNase的洗脱T1处理（粗糙的cDNA展示）（6.49％），（5）固定化镍珠的上清液（0.32％），（6）Ni-NTA洗脱（纯化的cDNA展示）（5.15％）。
夹心CD-IPCR检测目标蛋白GFP
1. 执行qPCR实验后，仪器附带的软件会自动准备扩增图并计算每个样品的Ct（阈值循环）值（图5）。表1列出了Ct值的代表性数据。
  
  表1. qPCR反应的Ct值
  
  图5. qPCR反应的标准曲线和扩增图
2. 通过从每种GFP浓度的样品Ct值中减去0 µg / ml（无分析物）的Ct值来计算ΔCt值（请参见表1）。
3. 使用 t 检验统计比较ΔCt值。ΔCt值随GFP浓度的增加而逐渐增加（从0.01 µg / ml增加到100 µg / ml），根据统计分析，最低检测浓度为0.01 µg / ml （图6）。
  
  图6.夹心CD-IPCR检测靶蛋白GFP的ΔCt值。 ***表示 P ＆lt; 0.05，**表示 P ＆lt; 0.001。n = 3（误差线表示SD）。

菜谱

2x上色染料（室温保存）
尿素24克
1％BPB 2.5毫升
1％XC 2.5毫升
0.5 M EDTA 0.1毫升
10倍TBE缓冲液1毫升
蔗糖4克
UPDW最多50毫升
10 ml的4％变性尿素聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）（准备并在实验前放置2-3-h）
4.8克8 M尿素
1 ml 5x TBE缓冲液
1毫升40％聚丙烯酰胺和10毫升以下的UPDW
用微波炉将内容物适当溶解并冷却
在倒入凝胶模具之前，立即添加25μl的20％过硫酸铵（APS）和10μl的四甲基乙二胺（TEMED）
5x TBE缓冲液1 L（在室温下保存）
54克Tris碱
27.5克硼酸
20 ml的0.5 M EDTA（pH 8.0）
0.5x工作溶液是45 mM Tris-borate / 1 mM EDTA
2个结合缓冲液（存储在4°C下）
20 mM Tris-HCl，pH 8.0
2毫米EDTA
2 M NaCl
0.2％Tween20
用无核酸酶的水准备
Ni-NTA结合/洗涤缓冲液（在4°C下储存）
20 mM磷酸氢二钠，pH 7.4,50 mM Tris-Cl （pH 8.0）
0.5 M氯化钠
5 mM咪唑
0.05％吐温20
Ni-NTA洗脱缓冲液（储存在4°C）
20 mM磷酸氢二钠，pH 7.4,50 mM Tris-Cl （pH 8.0）
500 mM氯化钠
250 mM咪唑
0.05％吐温20
SDS页胶（准备并在实验前2至3小时放置）
10 ml的6％分离胶
4.8克尿素（最终8 M）
1.5毫升丙烯酰胺（40％）
2.5毫升1.5 M Tris（pH 8.8）
100微升SDS（10％）
25 µl APS（20％）
5 µl TEMED
使用UPDW最多10毫升
5毫升4％堆积凝胶
0.5毫升丙烯酰胺（40％）
0.5毫升的1 M Tris（pH 6.8）
50微升SDS（10％）
15微升APS（10％）
5 µl TEMED
使用UPDW最多5毫升
0.2 M甘氨酸-HCl缓冲液（pH 2.2）（在室温下保存）
25 ml的0.2 M甘氨酸（15.01 g的1 L蒸馏水）
22 ml的0.2 M HCl
最多100毫升蒸馏水
1x SYBR金核酸凝胶菌株（储存在4°C）
5 µl 10,000x SYBR TM 金核酸凝胶染料
50 ml 1x Tris-EDTA（TE）缓冲液
40％丙烯酰胺

致谢

这项工作得到了KAKENHI的部分支持（NN的编号为15H05723和17K19471，TT的编号为16J01710、18H04535和18H02103）。TT还得到了JSPS奖学金的支持。该协议改编自我们最近的文章（Anzai et al。，2019）。我们尤其要感谢Anzai Hiroki先生和铃木Takeru先生所做的部分工作，以及Sa玉大学Nemoto实验室的其他成员在这项工作中的宝贵建议和支持。

利益争夺

作者已为cD-IPCR申请了专利。

参考文献

Anzai，H.，Terai，T.，Jayathilake，C.，Suzuki，T.和Nemoto，N.（2019）。一种使用cDNA展示的新型免疫PCR方法。 Anal Biochem em> 578：1-6。
Fridy，PC，Li，Y.，Keegan，S.，Thompson，MK，Nudelman，I.，Scheid，JF，Oeffinger，M.，Nussenzweig，MC，Fenyö，D.，Chait，BT and Rout，MP（2014））。一个用于快速生产通用纳米抗体库的强大管道。自然方法 11（12）：1253-1260。
郭永昌，周玉芳，张雪娥，张ZP，乔乔梅，毕丽娟，温锦江，梁明发和张金宝（2006）。噬菌体展示介导的免疫PCR。核酸研究 34（8）：e62。
亨德里克森（Hendrickson），急诊室（ER），特鲁比（Truby）TM，乔尔格（RD），马加里安（Majarian），西伯利亚（R. 使用共价DNA标记抗体和聚合酶链反应的高灵敏度多分析物免疫测定。 Nucleic Acids Res 23（3）：522-529。
Y Mochizuki，M.Biyani，S.Tsuji-Ueno，S.Suzuki，M.，Nishigaki，K.，Husimi，Y.和Nemoto，N.（2011）。通过新颖而通用的嘌呤霉素-连接子DNA一次性制备mRNA / cDNA。 ACS Comb Sci 13（5）：478-485。
Nemoto，N.，Kumachi，S.和Arai，H.（2018）。使用cDNA展示体外选择单域抗体（VHH） Methods Mol Biol 1827：269-285。
佩德拉克（Pédelacq），法学博士（JD），卡巴努斯（Cabantous），S.Tran，T。，特威利格（Terwilliger），TC和沃尔多（GS）（2006）。工程和超级文件夹绿色荧光蛋白的表征。 Nat Biotechnol 24（1）：79-88。
Sano，T.，Smith，CL和Cantor，CR（1992）。免疫PCR：通过特异性抗体-DNA偶联物进行非常灵敏的抗原检测。 Science 258（5079）：120-122。
铃木（T.Suzuki），Mochizuki（Y.），木村（S.Kimura），Y.Akazawa-Ogawa（Y。），Y.Hagihara（and木原）和N.Nemoto（2018）。抗-survivin单域抗体衍生自人工库，其中包含三个人工合成的随机区域， Biochem Biophys Res Commun 503（3）：2054-2060。
Terai，T.，Anzai，H.和Nemoto，N.（2019）。使用与pH依赖的方式与染料偶联的固体表面缔合的肽的选择cDNA显示。 ACS Omega 4（4）：7378-7384
van Buggenum，JAGL，Gerlach，JP，Eising，S.，Schoonen，L.，van Eijl，RAPM，Tanis，SEJ，Hogeweg，M.，Hubner，NC，van Hest，JC，Bonger，KM and Mulder，KW（ 2016）。一种共价且可裂解的抗体-DNA偶联策略，用于通过免疫PCR检测敏感蛋白。科学代表（Sci Rep） 6：22675。
Yamaguchi，J.，Naimuddin，M.，Biyani，M.，Sasaki，T.，Machida，M.，Kubo，T.，Funatsu，T.，Husimi，Y.和Nemoto N.（2009）。 cDNA展示：一种通过固相合成和稳定化功能对富含二硫键的多肽进行筛选的新方法mRNA-蛋白质融合物。核酸研究 37（16）：e108。