材料和试剂

iPSC细胞培养
1. 6孔板（Corning，目录号：3506）
2. 针头过滤器0.2μm（VWR，目录号：28145-501）
3. Soft-Ject ®三部分式一次性注射器，Air-Tite-3 ml（VWR，目录号：89215-234）
4. 5 ml硼硅酸盐血清移液管（Fisher Scientific，目录号：1367827E）
5. 5 ml血清移液器（生物先锋，目录号：GEX0050-S01
6. 10 ml血清移液管（Bio Pioneer，目录号：GEX0100-S01）
7. P20移液器吸头，无菌，带过滤器
8. P1000移液器吸头，无菌，带过滤器
9. 15 ml锥形管（Bio Pioneer，目录号：CNT-15R）
10. iPSC细胞
11. 70％乙醇
12. UltraPure TM 不含DNase / RNase的蒸馏水（Thermo Fisher Scientific，目录号：10977023）
13. 康宁® Matrigel ®生长因子降低（GFR）地下室膜基质（Corning，目录号：354230）
14. mTeSR TM 1（干细胞技术公司，目录号：85850）
15. DMEM / F-12培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：11330057）
16. Dispase II（Thermo Fisher Scientific，目录号：17105041）
17. 基质胶溶液（Matrigel）（请参阅配方：表1）
18. 10 mM ROCK抑制剂，Y-27632二盐酸盐溶液（ROCK抑制剂）（请参阅配方：表2）
19. 10倍分配（请参阅食谱：表3）
20. mTeSR TM 1完全培养基（mTeSR）（请参阅食谱：表4）
单层电镀
1. 100 mm组织培养皿（Corning，目录号：430167）
2. 自动细胞计数片（Bio-Rad Laboratories，目录号：1450019）或血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：1483）或同等功能。
3. 5 ml血清移液管（Bio Pioneer，目录号：GEX0050-S01）
4. 10 ml血清移液器（生物先锋，目录号：GEX0100-S01
5. P20移液器吸头，无菌，带过滤器
6. P200移液器吸头无菌，带过滤器
7. P1000移液器吸头，无菌，带过滤器
8. 15 ml锥形管（Bio Pioneer，目录号：CNT-15R）
9. 50 ml锥形管（Bio Pioneer目录号：CNT-50R）
10. 70％乙醇
11. 康宁®基质胶®生长因子降低（GFR）的地下膜基质（Matrigel）（Corning，目录号：354230）
12. mTeSR TM 1（干细胞技术公司，目录号：85850）
13. DMEM / F-12培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：11330-057）
14. Accutase（Innovative Cell Technologies，Inc.，目录号：AT 104）
15. 台盼蓝溶液，0.4％（Thermo Fisher Scientific，目录号：15250061）
16. ROCK抑制剂，Y-27632二盐酸盐（塞勒克下摆，目录号：S1049）
17. iPSC细胞培养
18. 基质胶溶液（请参见配方：表1）
19. 10 mM ROCK抑制剂，Y-27632二盐酸盐溶液（请参见配方：表2）
20. mTeSR TM 1完全培养基（请参见配方：表4）
iPSC-RPE分化
1. 100 mm组织培养皿（Corning，目录号：430167）
2. （可选）排气的T150组织培养瓶（西格玛，目录号：Z707929）
  注意：在编写本手稿时，Z707929已不再可用。相同的烧瓶的商品目录号为Z707511-36EA（Sigma，商品目录号为Z707511-36EA）。
3. 70μm过滤器（Fisher Scientific，目录号：431751）
4. 自动细胞计数片（Bio-Rad Laboratories，目录号：1450019）或血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：1483）或同等产品
5. 10 ml血清移液管（Bio Pioneer，目录号：GEX0100-S01）
6. 25 ml血清移液管（Bio Pioneer目录号：GEX250-S01）
7. 50 ml血清移液管（Bio Pioneer，目录号：GEX500-S01）
8. P20移液器吸头，无菌，带过滤器
9. P200移液器吸头无菌，带过滤器
10. P1000移液器吸头，无菌，带过滤器
11. 细胞刮板机（VWR International，目录号179707）
12. 15 ml锥形管（Bio Pioneer，目录号：CNT-15R）
13. 50 ml锥形管（Bio Pioneer，目录号：CNT-50R）
14. Nalgene低温瓶（Thermo Fisher Scientific，目录号：5000-1020）
15. iPSC单层
16. 70％乙醇
17. 康宁®基质胶®生长因子降低（GFR）的地下膜基质（Matrigel）（Corning，目录号：354230）
18. DMEM / F-12培养基（Thermo Fisher Scientific，目录号：11330057）
19. DMEM介质（Thermo Fisher Scientific，目录号：11965092）
20. 火腿F12营养混合物（Thermo Fisher Scientific，目录号：11765054）
21. 1个不含钙和镁的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：14190250）
22. B27补充剂（50x），无血清（Thermo Fisher Scientific，目录号：17504044）
23. KnockOut TM 血清置换（KOSR）（Thermo Fisher Scientific，目录号：10828028）
24. L-谷氨酰胺200 mM（Thermo Fisher Scientific，目录号：25030081）
25. MEM非必需氨基酸溶液100x（Thermo Fisher Scientific，目录号：11140050）
26. 青霉素-链霉素（10,000 U / ml）（Thermo Fisher Scientific，目录号：15140122）
27. β-巯基乙醇（Thermo Fisher Scientific，目录号：21985023）
28. Accutase（Innovative Cell Technologies，Inc.，目录号：AT 104）
29. 烟酰胺（Sigma，目录号：N3376）
30. Chetomin（Sigma，目录号：C9623）
31. 台盼蓝溶液，0.4％（Thermo Fisher Scientific，目录号：15250061）
32. 二甲基亚砜（DMSO）（Sigma，目录号：D2650-100ML）
33. 液氮
34. RPE DM介质（请参阅配方：表5）
35. RPE介质（请参阅配方：表6）
36. 2x iPSC-RPE冷冻培养基（请参阅配方：表7）
37. 1 mM Chetomin溶液（请参见配方：表8）
38. 1 M烟酰胺（100x）溶液（请参见配方：表9）
流式细胞仪
1. 96孔圆底测定板（Genesee Scientific，目录号：25-224）
2. 带有细胞过滤器卡扣帽的康宁 TM Falcon TM 试管（Fisher Scientific，目录号：352235）
3. 康宁 TM CostarT M 无菌一次性试剂容器（Fisher Scientific，目录号：4870）
4. 5 ml血清移液管（Bio Pioneer，目录号：GEX0050-S01）
5. 10 ml血清移液管（Bio Pioneer，目录号：GEX0100-S01）
6. P20移液器吸头，无菌，带过滤器
7. P200移液器吸头无菌，带过滤器
8. P1000移液器吸头，无菌，带过滤器
9. P20移液器吸头，无过滤器
10. （可选）不带过滤器的P200移液器吸头
11. 带有BD GolgiStop TM 的固定/通透溶液套件（BD Biosciences，目录号：554715）
12. 1个不含钙和镁的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：14190250）
13. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma，目录号：A2153-100G）
14. （可选）NaN3（Sigma，目录号：S2002-5G）
15. 37％甲醛（Sigma，目录号：F-1635-500ML）
16. 兔抗ZO-1多克隆抗体（abcam，目录号：ab59720）
  注：在编写此手稿期间，抗体ab59720不再可用。可能的替代产品：abcam，目录号：ab221547。
17. 小鼠单克隆抗MiTF抗体（abcam，目录号：ab12039）
18. 重组兔IgG，单克隆[EPR25A]-同型对照（abcam，目录号：ab172730）
19. 小鼠IgG1，κ单克隆抗体[15-6E10A7]-同型对照（abcam，目录号：ab170190）
20. 驴抗兔Alexa Fluor TM 647共轭抗体（abcam，目录号：ab150075）
21. 山羊抗小鼠Alexa Fluor TM 488偶联抗体（Thermo Scientific，目录号：A-11001）
22. FACS缓冲液（请参阅配方：表10）
23. FACS-FIX缓冲区（请参阅配方：表11）
注意：有关抗体的工作浓度，请参见配方：表15。
免疫荧光
1. Millicell EZ SLIDE 8孔玻璃载玻片（Millipore，目录号：PEZGS0816）
2. 盖玻片（Fisherbrand，目录号：12-545-F）
3. 5 ml血清移液管（Bio Pioneer，目录号：GEX0050-S01）
4. 10 ml血清移液管（Bio Pioneer，目录号：GEX0100-S01）
5. P20移液器吸头，无菌，带过滤器
6. P200移液器吸头无菌，带过滤器
7. 1个不含钙和镁的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）（Thermo Fisher Scientific，目录号：14190250）
8. 牛血清白蛋白（BSA）（Sigma，目录号：A2153-100G）
9. 多聚甲醛（PFA）
10. Tween ® 20（Sigma，目录号：P9416-100ML）
11. 海卫一X-100（制造商，目录号：X-100-500ML）
12. 康宁®基质胶®生长因子降低（GFR）的地下膜基质（Matrigel）（Corning，目录号：354230）
13. 兔多克隆抗ZO-1抗体（abcam，目录号：ab59720）
14. 小鼠单克隆抗MiTF抗体（abcam，目录号：ab12039）
15. 小鼠单克隆抗Bestrophin 1抗体（Novus Biologicals，目录号：NB300-164SS）
16. 重组兔IgG，单克隆[EPR25A]-同型对照（abcam，目录号：ab172730）
17. 小鼠IgG1，κ单克隆抗体[15-6E10A7]-同型对照（abcam，目录号：ab170190）
18. 驴抗兔Alexa Fluor TM 647共轭抗体（abcam，目录号：ab150075）
19. 山羊抗小鼠Alexa Fluor TM 488偶联抗体（Thermo Scientific，目录号：A-11001）
20. 具有DAPI的ProLong金抗褪色试剂（Cell Signaling Technologies，目录号：8961）
21. 中频洗涤缓冲液（参见配方：表12）
22. IF烫发缓冲液（请参阅配方：表13）
23. 中频染色缓冲液（见配方：表14）
注意：有关抗体的工作浓度，请参见配方：表15。

设备

iPSC细胞培养
1. 生物安全柜（Labconco，型号：Logic +）
2. 具有湿度和气体控制功能的培养箱可在空气中5％CO 2 的气氛中维持37°C和95％湿度（Panasonic，型号：MCO-170AICUVH-PA）
3. 水浴（Thermo Scientific，型号：Precision）
4. 带转子的组织培养离心机，用于15 ml锥形管和50 ml锥形管（Thermo Scientific，型号：Legend RT +）
5. 相衬倒置显微镜（物镜：x4，x10，x20）（奥林巴斯，型号：CKX41SF）
6. （可选）带相机的相衬倒置显微镜（物镜：x4，x10，x20）（Thermo Scientific，型号：EVOS XL Core）
7. 显微镜物标（Nikon，MBW10020型）
8. 移液器辅助
9. P20微量移液器
10. 冷冻室-20°C
11. 冰箱2-8°C
单层电镀
1. 生物安全柜（Labconco，型号：Logic +）
2. 具有湿度和气体控制功能的培养箱可在空气中5％CO 2 的气氛中维持37°C和95％湿度（Panasonic，型号：MCO-170AICUVH-PA）
3. 带转子的组织培养离心机，用于15 ml锥形管和50 ml锥形管（Thermo Scientific，型号：Legend RT +）
4. 相衬倒置显微镜（物镜：x4，x10，x20）（奥林巴斯，型号：CKX41SF）
5. 带相机的相衬倒置显微镜（物镜：x4，x10，x20）（Thermo Scientific，型号：EVOS XL Core）–可选
6. 移液器辅助
7. P20微量移液器
8. P200微量移液器
9. P1000微量移液器
10. 自动细胞计数器（Bio-Rad，型号：TC20）或血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：1483）或同等产品
11. 冷冻室-20°C
12. 冰箱2-8°C
iPSC-RPE的分化和冷冻保存
1. 生物安全柜（Labconco，型号：Logic +）
2. 具有湿度和气体控制功能的培养箱可在空气中5％CO 2 的气氛中维持37°C和95％湿度（Panasonic，型号：MCO-170AICUVH-PA）
3. 带转子的组织培养离心机，用于15 ml锥形管和50 ml锥形管（Thermo Scientific，型号：Legend RT +）
4. 相衬倒置显微镜（物镜：x4，x10，x20）（奥林巴斯，型号：CKX41SF）
5. （可选）带相机的相衬倒置显微镜（物镜：x4，x10，x20）（Thermo Scientific，型号：EVOS XL Core）
6. 移液器辅助
7. P20微量移液器
8. P200微量移液器
9. P1000微量移液器
10. 自动细胞计数器（Bio-Rad，型号：TC20）或血细胞计数器（Hausser Scientific，目录号：1483）或同等功能。
11. Frosty先生冷冻容器（Corning，型号：CoolCell ® FTS30）
12. 冰箱2-8°C
13. 冷冻室-20°C
14. 冷冻室-80°C
15. 液氮蒸气罐
流式细胞仪
1. 移液器辅助
2. P20微量移液器
3. P200微量移液器
4. P1000微量移液器
5. P200多通道微量移液器
6. 冰箱2-8°C
7. 冷冻室-20°C
8. 流式细胞仪（BD Biosciences，型号：FACSCanto II）或同等
免疫荧光
1. 移液器辅助
2. P20微量移液器
3. P200微量移液器
4. P1000微量移液器
5. 冰箱2-8°C
6. 冷冻室-20°C
7. 共聚焦激光扫描荧光显微镜（Olympus，FluoView1000）

软件

FlowJo（版本10）（FlowJo，LLC， https://www.flowjo.com/ ）
FlowView ASW V03.01.03.03或V4.2a（奥林巴斯生命科学， https：// www.olympus-lifescience.com/en/support/downloads/ ）

程序

iPSC细胞培养
1. 解冻iPSC细胞
  1. 准备含有10μMROCK抑制剂的12 ml mTeSR。
  2. 将9 ml含10μMROCK抑制剂的mTeSR转移到标有管线名称的无菌锥形管中。
  3. 从液氮罐中取出冷冻保存的小瓶。将小瓶放在干冰上。
  4. 将其放在37°C水浴中轻轻摇动，直到剩下豌豆大小的冰晶（约2分钟）。
  5. 从小瓶中擦去多余的水，然后再将70％的乙醇喷入引擎盖。
  6. 从小瓶中取出融化的细胞，并在锥形管中轻轻加入9 ml含10μMROCK抑制剂的mTeSR中。用1-2 ml含10μMROCK抑制剂的mTeSR洗涤小瓶。将所有细胞收集在同一锥形管中。
  7. 在室温下以53 x g （在带有75006441 K桶的Sorvall 75006445转子中以500 RPM）离心细胞5分钟。
  8. 吸出上清液，然后将细胞沉淀轻轻重悬于2 ml含10μMROCK抑制剂的mTeSR中（将1个冷冻小管融化到6孔板的1个孔中）。
  9. 用行名称，克隆名称和传代号标记Matrigel板。从Matrigel涂层板上吸出DMEM / F-12。解冻后，在段落编号上加上+1。
    注意：如果在iPSC的低温保存过程中增加了传代次数，则不要在传代次数上加上+1。
  10. 将平板细胞重悬于2 ml溶液中，涂在Matrigel包被的6孔板的一个孔中（最终体积2 ml /孔）。
  11. 接种后24小时，观察细胞。用DMEM / F-12（2 ml /孔）轻轻洗涤细胞以去除细胞碎片，并使用不含ROCK抑制剂（2 ml /孔）的新鲜mTeSR培养基进料。
  12. 每天观察iPSC，去除分化的细胞，并用新鲜的mTeSR（2 ml /孔）更换培养基。
    注意：保持无iPSC文化分化的关键。
  13. 细胞应达到融合度的80-90％，并准备在5天内通过。
2. 使用Dispase进行iPSC传递
  1. 通过将9 ml DMEM / F-12添加到1 ml 10x Dispase（20 mg / ml）中，制备1x（2 mg / ml）Dispase溶液。
  2. 让1x Dispase溶液恢复到室温。
    注意：1x Dispase溶液可在4°C下最多保存2周。
  3. 使用显微镜对象标记在要拆分的孔上标记任何分化区域。
  4. 吸出用过的媒体。轻轻敲打标记圆圈内的巴斯德吸管，吸出标记的分化区域（如有）。每孔用2 ml DMEM / F-12洗涤。
  5. 在每个孔中加入1 ml 1x Dispase进行拆分。在37°C下孵育5分钟。
  6. 5分钟后检查菌落的形态。
    当菌落的边缘稍微卷曲时，细胞就可以传代了。如果菌落边缘未卷曲，则将细胞在37°C下再孵育1-2分钟。不要与Dispase一起温育超过8分钟。
  7. 从所有孔中吸出Dispase。
  8. 用DMEM / F12（2 ml /孔）轻轻冲洗孔3次。
  9. 向每个孔中加入1 ml mTeSR培养基进行传代。
  10. 使用玻璃血清移液管分离菌落。将移液器与平板表面成90°角。按照图1所示的动作刮擦6孔板的表面（从孔的左上侧开始，然后用锯齿紧紧地向下弯曲到右下角，然后顺时针或逆时针旋转板并再次刮擦）。刮擦直到至少有90％的菌落从孔中脱离。
    
    图1.在用Dispase传递iPSC期间，玻璃血清移液器的移动方式。沿一个方向刮擦孔后，将板顺时针或逆时针旋转90°，然后再次刮擦剩余的iPSC菌落。应从孔中分离出约90％的细胞。有关详细信息，请参阅有关使用Dispase进行iPSC传递的部分。
  11. 用使细胞升至播种新的Matrigel涂层容器所需的最终体积的mTeSR体积洗涤板。考虑到每个孔中要接种传代细胞的每个孔2 ml，计算最终体积。例如，如果要将细胞传代1-3次，则最终体积将为6 ml，因此用于洗涤板的mTeSR体积为5 ml。
  12. 在新的Matrigel板上接种种子细胞，每孔1 ml，然后再添加1 ml。平板细胞在孔的整个表面上滴落，以确保均匀铺板。
  13. 在显微镜下观察接种的细胞，以确保接种均匀。
  14. 放入37°C的培养箱中。将平板摇成T形，以将菌落块均匀分布在孔中。
  15. 轻轻铺板后二十四小时，在添加新鲜的mTeSR培养基之前，用DMEM / F-12洗涤细胞。
    注意：对于健康高效的iPSC培养，至关重要的是均匀铺板细胞。平板细胞均匀地分布在孔的整个表面上，当镀多个孔时，平板细胞均匀地分布在所有孔中。
单层电镀
注意：解冻iPSC线后，在铺单层之前至少用Dispase传代细胞一次。
1. 从培养箱中取出6孔板。当iPSC细胞达到约80％汇合度（细胞已准备好传代）时，iPSC细胞已准备好用于单层。标记所有需要去除的分化细胞。
2. 吸出用过的培养基。除去所有标记的分化细胞，并用DMEM / F-12（2 ml /孔）洗涤细胞。
3. 吸出DMEM / F-12，然后在6孔板的孔中加入1 ml室温Accutase。在37°C下孵育细胞8分钟。
4. 孵育8分钟后，每孔含5μMROCK抑制剂的mTeSR加入1 ml，并使用P1000移液器将细胞重悬为单细胞，而不刮板表面。用移液器吸移10-12次，将培养皿旋转180°（倒置），再移吸5次。在50 ml锥形管中收集所有孔中的细胞。您应该看不到任何细胞团块。
5. 用5 ml含5μMROCK抑制剂的mTeSR将所有孔洗涤两次。将所有细胞收集在同一锥形管中。
6. 在室温下以53 x g （在带有75006441441 K桶的Sorvall 75006445转子中以500 RPM）离心细胞7分钟。吸出上清液并将细胞重悬于10 ml含ROCK抑制剂的mTeSR中。
7. 如有必要，通过颠倒20次或更多次来混合合并的细胞悬液。使用0.4％的台盼蓝溶液进行活细胞计数。
  注意：iPSC细胞生存力应不低于80％。
8. 准备所需数量的单元格。最佳细胞数将取决于分化程度。iPSC-RPE分化方案需要每cm 2 2.5 x 10 4 活细胞（每100毫米培养皿2 x 10 6 ）。对于一个100毫米的培养皿，在15毫升的锥形管中准备11毫升的细胞悬浮液，其中含有2.2 x 10 6个细胞。通过颠倒试管20次，将细胞悬液充分混合。
9. 使用10毫升移液器向每100毫米培养皿中滴加10毫升细胞悬液。
  e（T形）。
注意：在板的整个表面上均匀铺板细胞至关重要。为帮助一次分配细胞均匀地镀上一个皿，然后将新镀的皿摇成十字形（T形）。
1. 将板放在培养箱中，不要堆叠板。将细胞孵育到第二天早上，在37°C，5％CO 2 处。
2. 第二天更换不含ROCK抑制剂的新鲜mTeSR培养基（10 ml / 100 mm培养皿）。用于iPSC-RPE细胞分化的单层细胞需要培养约4-5天，直到单层细胞达到80％融合为止。每天更换含有新鲜mTeSR的培养基。
iPSC-RPE的区别
请参阅图2，以了解区分方案的示意图。

图2。iPSC-RPE分化方案的示意图。烟酰胺（NIC），Chemomin（CTM）。培养iPSC单层直到细胞达到80％融合为止。iPSC-RPE分化是使用小分子（NIC和CTM）启动和驱动的。iPSC-RPE持续分化和扩展了总共12周。整个培养传代会促进iPSC-RPE细胞的扩增。改编自Smith et al。，2019.
1. 第0天（D0）–当iPSC单层达到约80％融合度时，通过用RPE DM培养基替换mTeSR培养基来启动iPSC-RPE分化（请参见食谱：表5）（24 ml / 100 mm皿）
2. 分化开始后的D1–24小时，将用过的RPE DM培养基替换为新鲜的RPE DM培养基，其中补充了10 mM烟酰胺（见配方：表9）和50 nM壳聚糖（见配方：表8）（24 ml / 100 mm皿）。
3. 每日更换用过的培养基，用新鲜的RPE DM培养基补充10 mM烟酰胺（NIC）和50 nM Chetomin（CTM）（24 ml / 10 cm皿）。
  注意：由于iPSC-RPE细胞具有很高的细胞数量，高的增殖速率和代谢活性，因此可以获得健康，稳定的iPSC培养物，因此强烈建议在整个分化过程中保持24 h培养基更换的时间表。 / em>
4. 在D14上，更换用过的新鲜RPE DM培养基补充10 mM烟酰胺（24 ml / 100 mm皿）的用过的培养基。
5. 每日更换用过的培养基，以及新鲜的RPE DM培养基和10 mM烟酰胺（24 ml / 100 mm皿）。
  注意：2-3周后，第一批细胞开始出现黑色素沉淀和特征性的多边形形状。
6. 在D28传代细胞–第一代。
  1. （可选）拍摄细胞图像–（图3-D28左面板）。
    
    图3. iPSC-RPE细胞的图像。 iPSC-RPE细胞在分化的第28天（D28）的明场图像表现为小的多角形色素细胞簇，它们在剩下的时间）; 在第84天（D84），装有iPSC-RPE细胞（iPSCORE 87_1）的T150烧瓶（左中）；第84天的iPSC-RPE样品（iPSCORE_42_1）的明场图像显示了高度组织化的单层膜，具有强烈的黑色素色素沉着（右中）和特征多边形形状（右）。改编自Smith et al。，2019.
  2. 吸出用过的培养基并用PBS（10 ml / 100 mm皿）洗涤细胞
  3. 吸出PBS，将5 ml室温Accutase加入100 mm皿中。在37°C下孵育细胞12分钟。
  4. 孵育12分钟后，每碟RPE DM培养基添加5 ml，使用P1000移液器将细胞重新悬浮在Accutase中作为单细胞，而不会刮擦板表面。如果难以从培养皿中取出细胞，请使用细胞刮刀。
  5. 将细胞收集在50 ml锥形管中。
  6. 再用3 ml RPE DM培养基洗涤板3次。将所有细胞收集在同一锥形管中。
  7. 在室温下，以136 x g （800 RPE在带有75006441 K桶的Sorvall 75006445转子中离心800分钟）离心细胞。
  8. 离心后，吸出上清液，并将细胞重悬于10 ml RPE培养基中（请参见配方：表6）。
  9. 轻轻将所有细胞通过70μm过滤器。添加培养基，使最终体积总计20毫升通过过滤器。
  10. 将细胞接种在两个新鲜的100毫米培养皿上，并用Matrigel包被过夜。
  11. 使用10毫升移液器，每100毫米培养皿中滴加10毫升细胞悬液。
    注意：在板的整个表面上均匀铺板细胞至关重要。为帮助一次将细胞均匀分布在一个培养皿中，并以十字形（T形）摇晃新培养的培养皿。
    可选：代替在一个T150烧瓶上使用两个100 mm皿式培养皿。
  12. ＆nbsp;将板放入培养箱中。将细胞在37°C，5％CO 2 中孵育至第二天，而无需将板堆叠。
7. 分割后二十四小时，将培养基换为新鲜的RPE培养基（10 ml / 100 mm皿）。如果使用T150烧瓶，请使用25 ml / T150烧瓶。
8. 每天更换培养基，换上新鲜的RPE培养基（10毫升/ 100毫米培养皿），持续4周。如果使用T150烧瓶，请使用25 ml / T150烧瓶。
9. 在D56传代中，细胞第二次传代。
  按照步骤C6a-C6g执行段落。
  注意：如果将细胞接种在T150烧瓶上，则将每个烧瓶用10 ml的Accutase孵育细胞，并使用刮板回收所有细胞。为了收集所有细胞，将烧瓶洗涤3次，每次用10 ml培养基洗涤。
  1. 离心后，吸出上清液，将细胞重悬于20 ml RPE培养基中。
  2. 轻轻将所有细胞通过70μm过滤器。添加培养基，使最终体积总计为50 ml，使至少20 ml的培养基通过滤网。
  3. 将细胞接种到两个新鲜的T150烧瓶中，并用Matrigel包被过夜。
  4. 使用10 ml移液管向每个T150烧瓶中逐滴添加25 ml细胞悬液。
    注意：至关重要的是，将细胞均匀地铺板在用Matrigel包被过夜的板的整个表面上。为帮助一次将细胞均匀地分布在一个烧瓶中，并以十字形（T形）摇动新接种的烧瓶。
  5. 将烧瓶放在培养箱中，不要堆叠。将细胞孵育到第二天早上，在37°C，5％CO 2 处。
10. 分流后二十四小时，更换新鲜RPE培养基（25 ml / T150烧瓶）。
11. 每天更换新鲜的RPE培养基（25 ml / T150烧瓶），持续4周。
12. 在D84上，收集所有细胞。
  1. （可选）拍摄单元格的图像。请参阅图3，以了解iPSC-RPE预期产量，色素沉着（图3 –面板中左和中右）和细胞形态（图3 –面板中右和右）的示例。
  2. 吸出用过的培养基，并用PBS（20 ml / T150烧瓶）洗涤细胞。
  3. 吸出PBS，向每个烧瓶中加入10 ml室温Accutase。在37°C下孵育12分钟。
  4. 孵育12分钟后，每孔加入10 ml RPE培养基重悬细胞。使用细胞刮板除去所有细胞。
  5. 将细胞收集在50 ml锥形管中。
  6. 再用10 ml RPE培养基洗涤板3次。将所有细胞收集在同一锥形管中。
  7. 在室温下，以136 x g （800 RPE在带有75006441 K桶的Sorvall 75006445转子中离心800分钟）离心细胞。
  8. 离心后，吸出上清液，将细胞重悬于20 ml RPE培养基中。
  9. 轻轻将所有细胞通过70μm过滤器。添加培养基，使最终体积总计为40 ml，使至少20 ml的培养基通过滤网。
  10. 颠倒20-30次，混合细胞悬液。使用0.4％台盼蓝溶液进行活细胞计数。
  注意：
  1. 使用自动细胞计数器对iPSC-RPE进行活细胞计数时，由于细胞中黑色素浓度高，可能无法准确地将细胞生存力评分为高。根据实验需要，可以将iPSC-RPE细胞冷冻保存用于将来的实验，固定用于流式细胞术分析和/或铺板用于免疫荧光分析。
  2. 培养2-3周后和每次传代后约1周，细胞开始获得黑色素色素沉着和特征性多边形形状。细胞开始获得色素沉着的最初迹象是培养基颜色略带灰色（“脏”）。当细胞色素沉着时，培养基也会获得深色。浓缩的iPSC-RPE细胞在D84处的细胞悬浮液呈黑色，类似于沉淀的iPSC-RPE细胞也呈黑色（图4）。
  图4. D84处iPSC-RPE细胞的图像。在离心前（左）和离心后（右）收集的iPSC-RPE细胞（iPSCORE_29_1）。
iPSC-RPE的冷冻保存
1. 通过在FBS中制备20％DMSO溶液来制备2x iPSC-RPE冷冻培养基。每个要冷冻保存的冷冻管，准备0.25 ml 2x iPSC-RPE冷冻培养基。冷冻细胞的最终密度为1.2 x 10 7 / ml（取决于下游实验，可以修改单个冷冻管中冷冻保存的iPSC-RPE细胞的体积和浓度）。
  可选：如果需要无血清条件，请使用KOSR代替FBS制备2x iPSC-RPE冷冻培养基。
2. 准备并打印冷冻管的标签。准备n + 2个标签数（n =要冷冻保存的冷冻管数量）。准备并粘贴所有要冷冻的冷冻管的标签，为Frosty先生使用一个标签，并为保存记录使用一个标签（ ie ，实验手册）。
3. 活细胞计数后（步骤C12j），确定应冷冻保存多少个细胞，并将所需数量的细胞转移到新的15 ml或50 ml锥形管中。
4. 在室温下以136 x g （在带有75006441 K桶的Sorvall 75006445转子中以800 RPM）离心细胞5-8分钟（根据细胞体积调整离心时间）。
5. 离心后，吸出上清液，将细胞悬浮于每个冷冻小管的0.25 ml FBS（或KOSR）中，以2.4 x 10 7 / ml（ ie ，对于10个冷冻保存的小瓶，将6 x 10 7 细胞重悬于2.5 ml FBS或KOSR中）。
6. 打开所有预先标记的冷冻管，并向每个冷冻管中添加0.25 ml细胞悬液。
7. 将0.25 ml的2x iPSC-RPE冷冻培养基添加到每个含有iPSC-RPE细胞悬液的冷冻管中。
8. 关闭所有冷冻小管，轻轻颠倒5-6次以混合细胞悬液和2x iPSC-RPE冷冻培养基。将冷冻管转移到Frosty先生的冷冻容器中。
9. 立即将Frosty先生转移到-80°C的冰箱中。冻结大量冷冻管时（ ie ，多个Frosty先生），请准备单独的批次，每批次仅包含可放入一个Frosty先生的冷冻管数量。
10. 24-48小时后，将细胞转移到液氮蒸气罐中。相应地更新记录（ ie ，箱形图）。
在这里，我们提供了流式细胞仪（FC）和免疫荧光（IF）的详细协议，可用于对衍生的iPSC-RPE细胞进行定量（FC）和定性（FC和IF）质量控制。
流式细胞仪
1. 活细胞计数后（步骤C12j），确定应固定多少细胞以进行流式细胞术分析，并将所需数量的细胞转移到15 ml锥形管中。至少使用2-5 x 10 6 电池。
2. 在室温下以136 x g （在带有75006441 K桶的Sorvall 75006445转子中以800 RPM）离心细胞5分钟。
3. 离心后，吸出上清液，将细胞重悬于10 ml PBS中。
  可选：如果用于流式细胞术的细胞悬液体积小于0.5 ml，则直接向细胞中加入14 ml PBS，并以136 xg（在Sorvall 75006445中为800 rpm）离心细胞和PBS的混合物8分钟带有75006441 K桶的转子）。
4. 根据制造商的建议，使用带有BD GolgiStop TM 的Fixation / Permeabilization Solution Kit固定和透化iPSC-RPE细胞。最后一次离心后，吸出上清液，将细胞以1 x 10 7 / ml的浓度重悬于1x BD Perm / Wash TM 缓冲液中。对于每种流式细胞仪染色，请使用2.5 x 10 5 细胞。
  注意：染色2.5 x 105个细胞可以有效利用细胞和试剂，但是每次染色也可以使用1 x 106个细胞，以保持相同的抗体稀释比。
5. 将25μl固定和透化的细胞转移到96孔圆底测定板的5孔中。为了限制对多条线染色时抗体和细胞的使用，请从每条线中混合相等数量的细胞，并将25μl细胞混合物转移至四个对照孔中[重组兔IgG，单克隆类别对照抗体（Rb-IgG），小鼠IgG1，κ单克隆抗体（M-IgG1），抗ZO-1抗体（ZO1）和抗MiTF抗体（MiTF）]。
6. 在表15之后，在每个孔中添加适当浓度的抗体。使用用于20μl的多通道移液器，通过上下移液20次，轻轻地混合细胞和抗体。
7. 在室温下将细胞与一抗孵育1小时。
8. 1小时后，添加150μlFACS缓冲液（请参见配方：表10）。
9. 从863 xg （转速为863 xg （2,000 rpm时，转速为863）室温下带有75006441 K铲斗的Sorvall 75006445转子）。
  详细：
  1. 将离心机设置为863 x g （2,000 RPM），1分钟，室温）; 启动离心机，直到速度达到863 x g （2,000 rpm）。
  2. 计数到8-10 s并停止离心。）离心后的沉淀应清晰可见，尤其是使用1 x 10 6 细胞时。
10. 离心后，轻轻吸出上清液，非常小心不要吸出任何细胞。如果使用真空抽吸细胞，请使用不带过滤器的P20吸头（或不带过滤器的P200 + P20吸头）。在每个孔中保留约20μl液体，以避免抽吸细胞。
11. 使用多通道移液器添加200μlFACS缓冲液，轻轻混合细胞5-6次。
12. 像步骤E9一样离心板。
13. 重复步骤E10-E12，再次洗涤细胞。
14. 将细胞重悬于50μl1x BD Perm / Wash TM 缓冲液中。
15. 在表15之后，在每个孔中添加适当浓度的抗体。使用用于40μl的多通道移液器，通过上下移液20次，轻轻地混合细胞和抗体。
16. 在黑暗中于室温下将细胞与二抗孵育45分钟。
17. 45分钟后，重复步骤E8-E13。
18. 最后一次离心后，吸出上清液，将细胞重悬于200μlFACS-FIX缓冲液中（参见配方：表11）。使用多通道移液器通过移液5-6次来重悬细胞。
19. 使用P1000移液器一次将每个样品转移到带有Cell Strainer Snap Cap的Corning TM Falcon TM 试管中，使细胞穿过盖中的过滤器。
20. 用另外的250μl洗涤每个孔，并转移到适当的试管中，使细胞穿过瓶盖中的过滤器。根据用于染色的细胞数量，将细胞稀释至适当的浓度，以免堵塞流式细胞仪。
21. 将所有管子放在适当的架子上，并用铝箔纸包裹以防光照。
22. 使用流式细胞仪FACS Canto II（或其他流式细胞仪）进行采集。
23. 使用FlowJo软件V 10.4执行流式细胞仪分析。有关iPSC-RPE流式细胞仪染色结果的示例，请参见图5。
  
  图5.第84天对iPSC-RPE（iPSCORE_42_1）的流式细胞术分析，显示Zonula Occludens 1（ZO-1）和小眼症相关转录因子（MiTF）的高共染色。史密斯等人，2019年。
免疫荧光
1. 用Matrigel将Millicell EZ SLIDE 8孔玻璃载玻片涂过夜。
2. 在Matrigel包被的Millicell EZ SLIDE 8孔玻璃载玻片上将新鲜或冷冻保存的iPSC-RPE细胞平板接种。每行以1-1.5 x 10 6 / cm 2 的密度接种至少6孔。
3. 培养细胞10天，直到它们完全融合，重新获得多边形形状和色素沉着。
4. 吸出培养基并用PBS洗涤细胞两次。吸出PBS。
5. 在室温下用4％PFA固定细胞10分钟。
6. 除去PFA溶液，并用新鲜制备的IF洗涤缓冲液洗涤细胞两次（请参见配方：表12）。吸出IF Wash Buffer。
7. 使用IF Perm Buffer浸透和渗透细胞（请参见配方：表13）。在室温下孵育细胞20分钟。
8. 在饱和和通透性的最后5分钟内，在IF染色缓冲液中准备一级抗体溶液（请参见配方：表14和表15）以获取适当浓度的抗体。将抗体溶液储存在冰上直至使用。
9. 饱和和透化后，吸出所有缓冲液，并将抗体溶液添加到适当的孔中。
10. 将细胞与抗体溶液在4°C下孵育过夜。
11. 第二天（早上）在IF染色缓冲液中准备二抗溶液。有关抗体的适当浓度，请参见表15 。将抗体溶液在冰上保存，直至使用，并避光。
12. 吸出一级抗体溶液，并用PBS洗涤细胞3次。最后清洗后，吸出所有PBS。
13. 立即将二抗溶液添加到适当的孔中。在黑暗中于室温下孵育细胞1小时。
14. 吸出二抗溶液并用PBS洗涤细胞三遍。最后清洗后，吸出所有PBS。
15. 卸下Millicell EZ SLIDE 8孔玻璃载玻片的壁。
16. 遵循制造商的建议，将ProLong金抗褪色剂与DAPI添加在一起，并轻轻地安装盖玻片，以免产生气泡。用铅笔橡皮轻轻地去除任何气泡。在黑暗中将载玻片在室温下存放数小时（最好直到第二天），以确保正确安装。
17. 使用适当的免疫荧光显微镜（最好是共聚焦激光扫描荧光显微镜）获取图像。有关iPSC-RPE免疫荧光染色的示例，请参见图6。
  
  图6. Bestrofin 1（BEST1）（iPSCORE_29_1），ZO-1（iPSCORE_29_1）和MiTF（iPSCORE_42_1）的免疫荧光分析。 ZO-1表现为清晰的细胞膜染色。与ZO1染色相比，BEST1膜染色显得“模糊”。MiTF核染色。改编自Smith et al。，2019。

菜谱

细胞培养试剂和培养基制备

表1.制备基质胶溶液

表2。1 . 10 mM ROCK抑制剂Y-27632二盐酸盐的制备

表3. 10倍分散液的制备

表4. mTeSRTM1完全培养基的制备

表5. RPE DM培养基的制备（继Maruotti等，2015年之后）

表6. RPE培养基的制备（紧随Maruotti等人，，2015年）

表7.制备2x iPSC-RPE冷冻培养基（5毫升）

表8.制备1 mM Chetomin溶液

表9. 1M烟酰胺（100x）溶液的制备
缓冲液制备

表10. FACS缓冲液的制备

表11. FACS-FIX缓冲液的制备

表12.中频洗涤缓冲液的制备

表13.中频烫发缓冲液的制备

表14.中频染色缓冲液的制备
抗体

表15.抗体浓度

致谢

这项工作得到了CIRM赠款GC1R-06673-B和NIH赠款HG008118，HL107442，DK105541，DK112155和EY021237的部分支持。该协议改编自以前的工作（Smith，D'Antonio-Chronowska et al。，2019）。

利益争夺

作者宣称没有利益冲突。

伦理

从不同种族的个体（3个欧洲裔美国人，2个东亚裔美国人和1个非裔美国人）产生的iPSC品系是从iPSCORE获得的（Panopoulos et al。，2017）。捐赠时，捐赠者均为21至62岁的女性。招募这些人得到了加利福尼亚大学圣地亚哥分校的机构审查委员会和The Salk Institute的批准（项目号110776ZF）。

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