第一部分：挖掘和收集用于隔离微生物的黏土容器的准则（现场工作）

材料和试剂

实验室手套
50 ml猎鹰管（MINIPLAST EIN SHEMER，目录号：835-050-21-111）
清洁塑料容器
铝箔
管标记

设备

折叠桌
记录设备，包括相机，平板电脑，笔记本电脑和手机

程序

注意：在预期用于分离微生物的容器的场所，请勿在挖掘区域内放置任何食物或饮料（主要是水果，蔬菜，啤酒，酸奶，面包，咸菜，奶酪以及其他食物或饮料）。

挖掘前后
1. 定义要收集以隔离微生物的容器。例如：
  1. 显然用于存放，供应和饮用饮料或食品的容器，或带有过滤功能的具有饮料相关特定功能的容器（图1）。
  2. 建议船只以前曾被用于制备发酵饮料和食品，例如乳制品（例如搅棒）。
  3. 有关更多示例，另请参阅Aouizerat et al。（2019）。
  提高团队的意识，以便他们准备根据现场情况收集容器以隔离微生物。例如，在就地发现饮具或可能的生产场所的情况下。
2. 确保现场不食用任何发酵食品，包括未经过滤的啤酒，酸面团和葡萄酒。另外，建议工人在开始工作之前洗手和洗脸。
  
  图1.假定的啤酒罐。一个由于其形状和过滤器而被认为是啤酒罐的容器的示例。
现场挖掘和样品处理
1. 在完全发现之前，请尽快就地识别适合微生物分离的容器。
2. 视觉记录挖掘过程，并在从土壤中提取船只之前，在其上下文中完整记录船只（绘图，摄影，文字描述）。
3. 在容器附近放置折叠桌，并用干净的铝箔覆盖桌子。
4. 从现在开始，使用一次性实验室或棉质手套在此容器上工作。
5. 当发现被识别的船只时，根据挖掘机的政策和政府法规决定是否可以破坏多少船只。
6. 最初发现后，立即取一小块（5-6厘米）的容器，并始终用手套将其转移到50毫升试管中。
  注意：在首次取样之前，请尽量减少容器暴露时间。
7. 用管标记器在管上贴标签，并记录时间，地点，特定环境，挖掘机和棚架类型。
8. 小心地使用实验室手套，按照开挖的常规规程开挖船只。
  注意：只有专职和有指导的人员，最好只有一名人员，才能接触花架，以避免可能的污染。
9. 揭露时，确定容器中最可能容纳微生物的部分，例如底部，滤网和弯曲部分朝向颈部。从现在开始，船只的这些部分将成为工作重点。
10. 将收集的碎片转移到桌子上，将其保存在塑料容器中，并相应地贴上标签。
  注意：请勿清洗用于分离微生物的碎片。
11. 用相同的ID标记将要发送到实验室的未发现容器的其他碎片，以保留它们以进行恢复和其他分析。
12. 始终不要洗一些碎片，以防实验室需要更多碎片。
13. 将带有用于微生物分析的托盘的塑料容器转移到微生物实验室（请参见下文）。
  注意：在特定情况下，可以选择整个容器去实验室。在这种情况下，请尽量减少容器暴露的时间并进行挖掘，并尽快记录并转移到塑料容器中。
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  对照容器和对照土壤样品：
  注意：非相关控制是分析中的关键组成部分，以确保分离出的微生物起源于容器而不是环境污染。
14. 使用手套，从船只周围收集尽可能多的样本：沉积物，石头，植物和根。将它们存放在50毫升塑料管中。
15. 确定很有可能与微生物无关的容器，例如燃烧的炊具，小容器/容器（假定的香水容器）和其他容器，并按上述方法处理假定发酵的容器食品容器。
  注意：由于酵母是主要的油类居住者，因此不应将怀疑装有油性产品的容器视为对照（Aouizerat等人，2019）。
C. 送到实验室
1. 始终使用手套将试管，容器及其文件转移到实验室。
2. 在室温下室内存放。

第二部分：从环境样品中分离和鉴定酵母（在实验室中）

材料和试剂

用于酵母分离
1. 50 ml无菌猎鹰管（MINIPLAST EIN SHEMER，参考：835-050-21-111）
2. 15 ml无菌猎鹰管（MINIPLAST EIN SHEMER，参考：835-015-40-111）
3. S的实验室菌株。酿酒酵母作为对照。我们使用了Sefale S-04（Fermentis）
4. YPD肉汤（Difco，目录号：bbl242820）
5. 琼脂（Bacto TM Agar，BD，目录号214010）
6. 选择性琼脂平板：补充了氯霉素和庆大霉素4毫克/毫升的Sabouraux葡萄糖琼脂（NOVAmed Israel，目录号：BA-114）
用于酵母DNA纯化
1. AMPure XP磁珠（新英格兰BioLebs，目录号：E6270）
2. 酸洗玻璃珠（Sigma-Aldrich，目录号：G4649）
3. 冰块
4. RNase A（10 mg / ml不含DNase和蛋白酶的RNase，Thermo Fisher Scientific，目录号：EN0531）
5. 无菌ddH2O
6. 比率为25：24：1的苯酚：氯尿：异戊醇分别在pH 8时用Tris（10 mM）和EDTA（1 mM）饱和（Sigma-Aldrich，目录号：P3803）
7. Tris-HCl，pH 8.0（10 mM），EDTA，pH 8.0（TE缓冲液，Thermo Fisher Scientific，目录号：AM9858）
8. 醋酸铵（Sigma-Aldrich，目录号：A1542）
9. 乙醇（以色列加多特）
10. Nextera XT DNA试剂盒（Illumina，目录号：FC-131-1096）
11. 麦芽提取物（Chen Shmuel化学品，以色列）
12. 啤酒花（Hopsteiner，啤酒花颗粒90）
13. 甘油（50％）（生物实验室）
14. PBS缓冲液
15. “ Smash and Grab”裂解溶液（Harju等，2004年）（请参阅食谱）

设备

实验室玻璃烧瓶
各种规格的移液器（Eppendorf）
可以加热到30°C的培养箱（QSR Technologies）
孵化器摇床（New Branswick Scientific，Exella E24孵化器摇床）
分光光度计（VWR，v-1200分光光度计）
离心机（Eppendorf，5430R离心机）
酶标仪– Synergy TM 2多模式酶标仪（BioTek）
DNA定量设备，例如Qubit（Invitrogen，Qubit ® 2.0荧光计）
-80°C冰箱（Thermo Scientific TM ，目录号：5IDTSX）
涡旋（Fisher Scientific，Fisher STD迷你涡旋仪230v）
任何类型的通风柜，均可用于与苯酚：氯霉素：异戊醇一起使用
层流罩（Thermo Scientific TM ，MSC-Advantage TM ）
PCR罩（实验室伴侣）
PCR热循环仪（QSR Technologies，热循环仪GE48529）
显微镜（蔡司，AXIO Lab.A1）
连接到PC的显微镜相机（蔡司，AXIOCAM 105色）

软件

96孔读板器软件（BioTek，Gen5 2.07）
GraphPad Prism 8.0.2（ https://www.graphpad.com/ ）
Geneious Pro 2019（ https://www.geneious.com/ ）
显微镜软件（蔡司，ZEN2蓝色版）
Trimmomatic 0.36（Bolger等，2014）
FastQC（ http://www.bioinformatics.bbsrc.ac.uk/projects/fastqc）
Celera汇编器8.3rc2（迈尔斯等人，2000年）
BlobTools V1（Laetsch and Blaxter，2017）
R（ https://www.r-project.org ）和“ growthcurver”包（ https://cran.r-project.org/web/packages/ growthcurver / vignettes / Growthcurver-vignette.html ）

程序

注意：请定期戴手套和实验室安全设备（例如， ie ，实验室外套，护目镜）进行工作。开始的步骤不需要无菌的工作条件。但是，最初分离出酵母后，请在层流罩或燃烧器附近工作。

从容器和对照样品中分离酵母
1. 将棚架放入塑料容器中，并用无菌液体YPD培养基覆盖。
2. 在室温下孵育7天，不要摇晃。
3. 从选择性琼脂平板上的培养基中散布0.1 ml样品，以进行真菌分离，并在30°C下孵育12至48 h。
4. 经常检查培养皿中酵母菌落的外观（图2A）。
  注意：酵母菌落通常比霉菌和丝状真菌生长快。不要等待超过48小时，否则板子会被霉菌和丝状真菌覆盖。
  
  图2.酵母菌落和细胞。酵母菌具有典型的菌落和细胞形态，两者均不同于霉菌和细菌。A.从古代船只中分离出来的几种酵母菌落（Aouizerat等人，2019）。通常，与通常小而无光泽的细菌菌落相反，酵母菌落相对较大，具有发亮的白色。B.在光学显微镜（60x）下观察到的酵母细胞。请注意，酵母细胞通常比典型细菌大，许多酵母通过出芽而不是分裂而分裂。C.上板，如第二部分的方法A中所述铺板用于真菌分离的选择性琼脂板。请注意，由于抗生素（蓝色圆圈），霉菌的结构（绿色圆圈）和酵母的独特闪亮菌落（红色圆圈）而导致的细菌菌落数量少。在底部面板中，将一个酵母菌落挑出并在YPD板上重新划线（红色箭头）。
5. 收集任何似乎是酵母菌落的菌落，使用光学显微镜观察典型的酵母细胞（图2B），并将其铺在含有2％w / v细菌琼脂的固态YPD琼脂板上（图2C）。
6. 将平板在30°C下孵育24-48小时，直到清楚地观察到酵母菌落为止。
  注意：如果霉菌和酵母菌的混合物生长，请重新挑选一个单独的酵母菌落到新的YPD板上，然后重复步骤A6。
7. 目视检查菌落，并在光学显微镜下（放大60倍）检查典型的酵母细胞是否不同于细菌菌落（图2）。
8. 要制作酵母的冷冻原液，请在5 ml YPD发酵液中挑选一个菌落，并在有氧条件下（250-300 rpm）的振动培养箱中于30°C的条件下于30°C孵育24 h。
9. 将0.5 ml的培养物与无菌的0.5 ml甘油（50％）混合，涡旋混合，等分并在-80°C下保存。
酵母特性
1. 酵母DNA分离
  注意：酵母细胞DNA的分离如先前所述（Holm et al。，1986）。
  1. 从-80°C中选择一个装有酵母的试管，并在室温下解冻。解冻后，在YPD板上进行分离条纹，并在30°C下孵育直至观察到菌落（约48 h）。
  2. 将单个菌落转移到无菌100 ml烧瓶中的10 ml YPD肉汤中。将酵母在30°C下以200 rpm摇动生长过夜。
  3. 将培养物转移到50 ml Falcon试管中，并以1,000 x g 离心5分钟。倒出上清液，将沉淀重新悬浮在无菌水中，重新离心并丢弃上清液。
  4. 在通风橱中，加入200 µl的苯酚：氯霉素：异戊醇，0.3 g的酸洗玻璃珠和200 µl的Smash and Grab溶液并涡旋3分钟以裂解细胞。
  5. 加入0.2 ml TE缓冲液，并在室温下以1,000 x g 离心细胞5分钟。
  6. 将含有DNA的水层转移至1 ml乙醇中，并于-80°C孵育20分钟。
  7. 通过以10,000 x g 离心5分钟洗涤，然后重悬于0.4 ml TE缓冲液中。
    注意：DNA沉淀物是透明的，很难看到，避免丢失沉淀物。
  8. 加入1微升RNA酶A。
  9. 将溶液在37°C下孵育5分钟。
  10. 加入10 µl乙酸铵（4 M）和1ml 70％乙醇，在-80°C下孵育20分钟。
  11. 以最大速度离心10分钟（至少15K x g ）并弃去上清液。
  12. 将沉淀重悬于50 µl TE缓冲液中。
  13. 用Qubit定量DNA，应为10-20 µg / ml。
  14. 将提取的DNA储存在-20°C。
2. 通过内部转录间隔子（ITS）鉴定酵母
  1. 使用标准PCR试剂盒扩增ITS区域，并使用Illumina的引物编程：ITS1F; ACACTGACGACATGGTTCTACACTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA和ITS2R；TACGGTAGCAGAGACTTGGTCTGCTGCGTTCTTCATCGATGC。
  2. 发送PCR片段以进行Sanger测序。
  3. 对ISHAM条码数据库（ http://its.mycologylab.org ）和NCBI数据库（ https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi ）。
3. 全基因组测序和组装
  注意：DNA测序可以使用任何常用的NGS技术进行。我们的文库是使用Nextera XT DNA试剂盒（Illumina，圣地亚哥，加利福尼亚）制备的，DNA通过有限循环PCR扩增，然后使用AMPure XP珠进行纯化。使用NextSeq平台将DNA文库标准化，合并并标记在普通流动槽中，以2 x 250个碱基对末端读取。有关更多详细协议，请参阅（Aouizerat et al。，2019）。也可以使用多种NGS分析工具进行组装。在这里，我们描述了我们执行的分析（Aouizerat等，2019年）。
  1. 使用Trimmomatic 0.36卸下Illumina适配器。
  2. 使用FastQC确定读取的质量。
  3. 使用Celera汇编器8.3rc2执行De-novo组装。
  4. 使用BlobTools V1排除非目标物种的支架。
4. 生长曲线分析（麦芽汁）
  注意：此程序用于比较在各种条件下（例如，不同的培养基，温度和添加的不同化合物）下液体中酵母或细菌的各种生长参数。在此，进行啤酒麦芽汁中酵母的生长，以测试过去是否可能在这种条件下选择了分离的酵母。作为的阳性对照，我们使用了现代啤酒生产菌株 S。啤酒（可商购），它是不产生啤酒的病原酵母假丝酵母假丝酵母的阴性对照。
  
  麦芽准备
  注意：麦芽汁是根据标准配方制备的（Kunze and Manger，2004）。
  1. 将水（5 L）加热到72°C的巴氏灭菌温度。
  2. 加入麦芽提取物至终浓度为100 g / L，同时充分搅拌，并在63至67°C的温度下一起注入30分钟。
  3. 将溶液温度提高到100°C。
  4. 添加1 g / L啤酒花。
  5. 煮沸溶液45分钟。
  6. 同时，将水和冰块混合，准备5升冰冷的水。
  7. 再次添加1 g / L啤酒花。
  8. 再煮一分钟。
  9. 向混合物中加入先前准备的冰冷水（来自f节）。
  10. 将麦芽汁转移到无菌烧瓶中，并保持在4°C下。
  增长曲线比较
  1. 从YPD琼脂平板上的冷冻原液中分离出酵母菌条纹。
  2. 将平板在30°C下孵育48小时。
  3. 将菌落转移至20 ml液体YPD中，并在有氧条件下搅拌（250-300 rpm）在30°C下孵育。
  4. 将酵母以1,000 x g 离心5分钟，在无菌PBS缓冲液中洗涤，然后将沉淀重新悬浮在麦芽汁中。
  5. 用麦芽汁按1：100的比例稀释溶液。
  6. 一式三份或更多重复添加200μl稀释溶液/ 96孔板的孔。
  7. 将板在读板器中于30°C孵育，每20分钟线性振荡5 s，然后在48-96 h内读取光密度（OD 600 ）。
  8. 将结果导出到文本文件（图3A）。
  9. 使用R包“ growthcurver”（图3B）拟合一个逻辑方程。
  10. 使用学生的 t 检验比较各种参数之间差异的统计显着性。
  11. 使用主成分分析（PCA，R prcomp（）命令）确定样本之间的相对距离（图3C）。
  图3.生长曲线分析示例。 A.生长曲线作为酶标仪的输出读取。B.使用R增长曲线将逻辑曲线拟合到每条曲线。C.每个样品的逻辑方程的各个参数之间的距离的PCA表示。这些结果改编自Aouizerat et al。，2019。

笔记

对于DNA测序，我们争取了耶路撒冷希伯来大学Ein-Kerem校区的跨部门设备部门的帮助。

菜谱

“粉碎和抓取”裂解液
海卫一X-100（2％）
安全数据表（1％）
mM NaCl（100 mM）
pH 8.0（10 mM）的Tris-HCl
EDTA，pH 8.0（1 mM）

致谢

该协议改编自Aouizerat et al。（2019）。从古代容器中分离和鉴定活酵母细胞，作为生物考古学的工具。 mBio 10（2）：e00388-19。我们感谢耶拿大学的克里斯蒂娜·沃林纳教授的有益建议。

利益争夺

利益冲突声明：未声明。

参考文献

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