材料和试剂

Finntip移液器吸头（Finntip Flex 10、200和1,000）
1.5 ml微量离心管（VIOLAMO，F 1.5，目录号：1-1600-01）
12孔多培养皿（Thermo Fisher Scientific，目录号：130185）
半面积96孔微孔板（Greiner Bio-One，目录号：675075）
Zeba TM 旋转脱盐柱，40K MWCO，0.5 ml（件，目录号：87766）
拟南芥野生型植物（生态型：Col-0）
液氮
三（羟甲基）氨基甲烷（HEPES）（Nacalai Tesque，目录号：GR35406-91）
MgCl 2 （Nacalai Tesque，目录号：SP20937）
CaCl 2 （Nacalai Tesque，目录号：SP08894）
PMSF（Nacalai Tesque，目录号：SP96297）
cOmplete TM ，迷你型蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏，目录号：4693159001）
伯乐（Bio-Rad）蛋白分析试剂盒（伯乐（Bio-Rad）公司，目录号：5000001ja）
NADP / NADPH-Glo TM 分析试剂盒（Promega，目录号：G9081或G9082）
NaH 2 PO 4 （Nacalai Tesque，目录号：SP31737）
ATP（Nacalai Tesque，目录号：SP08886）
NAD + （Nacalai Tesque，目录号：GR24338）
NADP + （Nacalai Tesque，目录号：EP24336）
NADPH（Nacalai Tesque，货号：CP24340）
HCl（Nacalai Tesque，目录号：GR18322）
NaOH（Nacalai Tesque，目录号：SP06338）
蛋白质提取缓冲液（请参阅食谱）
反应缓冲液（请参见配方）
萤光素检测试剂（请参阅食谱）
NADP / NADPH Glo检测试剂（请参见食谱）

设备

移液器（Thermo Fisher Scientific，Finnpipette TM F2）
常规软木钻（直径4.0毫米）
均质杵（VIOLAMO，F-1.5，目录号1-2955-02）
冷冻微量离心机（TOMY，型号：MX305）
超声波破坏器（TOMY，型号：UR-21P）
吸收光谱仪（Thermo Fisher Scientific，Multiskan TM GO）
发光检测器（Promega，型号：GloMax TM 导航系统GM2000）

程序

建立常规的体外 NAD激酶测定
1. 蛋白质提取
  1. 用研钵和研杵在液氮中研磨新鲜分离的叶子（200-400 mg），然后加入300 µl冰冷的蛋白提取缓冲液（在使用前立即制备，配方1）。
    注意：我们的实验室通常使用三到四个星期大的玫瑰花叶，正午取样。由于NAD（P）的代谢在从营养生长到生殖生长的阶段过渡过程中会发生动态变化（Hashida 等人，2016），因此请务必在抽ing前准备好样品。我们建议至少进行三个生物学复制和两个技术复制以获得可靠的结果。
  2. 通过在冰上的输出控制6进行10 s的超声波处理，进一步破坏叶片样品。重复此步骤两次以彻底破坏叶绿体。
    注意：根据设备制造商的规格（UR-21P），输出控制6响应6瓦。超声波频率为28 kHz，指数喇叭的直径为2.5毫米。
  3. 在14,000 x g ，4°C下离心10分钟后，将上清液（ ie ，粗提取物）转移到1.5 ml微量离心管中以除去样品碎片。
  4. 使用Zeba TM 旋转脱盐柱通过4°C离心14,000 xg <去除NAD + ，NADH，NADP + 和NADPH 2分钟，并在新的1.5 ml微量离心管中收集含有提取蛋白的流道。
2. 蛋白质测量
  1. 通过用4倍体积的蒸馏去离子（DDI）水稀释1倍体积的染料浓缩液来制备用于Bio-Rad蛋白测定的染料。
  2. 将2和5 µl蛋白质提取物分别加入198和195 µl稀释的染料试剂中。
  3. 5分钟后，测量595 nm处的吸光度，并使用Bio-Rad蛋白质分析试剂盒中的蛋白质标准品II（BSA）估算蛋白质浓度（0.2至2.0 mg / ml）。
3. NAD + 磷酸化反应
  1. 在新的1.5毫升管式风箱中按以下数量混合配料：
    提取的蛋白质，10 µg
    反应缓冲液（配方2），10 µl
    50 mM NAD + ，10 µl
    50 mM ATP，10 µl
  2. 将混合物在30°C的水浴中孵育30分钟。
  3. 通过在95°C下加热样品2分钟来终止反应。
  4. 在4°C下于14,000 x g 离心5分钟后，使用上清液进行NADP测量（此处指定为“测量溶液”）。
设置叶绿体NAD激酶测定
1. NAD + 磷酸化反应
  1. 在DDI水的12孔板中漂浮新鲜准备的叶盘，然后将板置于黑暗中1 h（黑暗适应）。
    注意：我们的实验室每孔只使用12个叶片圆盘（直径4毫米），以避免在曝光期间产生交叉阴影（图1）。
  2. 在光（80 µmol光子/（s·m 2 ））下转移板，并通过将两个圆盘收集到装有80 µl的1.5 ml微量离心管中，开始终止反应的时间过程分别将0.2 N HCl（用于氧化形式的定量，NADP + ）和另外两个圆盘装入80 µl 0.2 N NaOH（用于定量还原形式，NADPH）。 > 注意：请确保准备空白控件（试管中没有叶子盘）。
  3. 将样品在95°C的热水浴中加热2分钟，然后用杵彻底夯打圆盘。加入8 µl 200 mM磷酸钠溶液（pH 5.6）后，用适当体积的0.2 N NaOH或0.2 N HCl将pH调节在5至6之间。
    注意：用试纸检查pH值。此pH值调整通常需要50至60 µl NaOH和HCl溶液。
2. 在14,000 x g ，4°C下离心5分钟后，使用上清液进行NADP测量，在此称为“测量溶液”。
  
  图1.叶盘用于叶绿体NAD激酶测定
NADP测量
1. NADP / NADPH-Glo TM 分析试剂的制备
  1. 对于基于发光的NADP检测，在所有测定之前准备所需量的荧光素检测试剂（配方3），并将其保存在室温（约23至25°C）下。当您获得“测量溶液”（见上文）时，请在使用前准备NADP / NADPH-Glo检测试剂（配方4）。
  2. 对于校准曲线，使用1 µM NADP + 和1 µM NADPH制备标准液。将0、1、2、3、4和5 µl NADP + 或NADPH标准品添加到半孔96孔微孔板的一系列孔中，并将每孔的体积调整为每孔50 µl空白控件。
  3. 将在步骤A3d或步骤B1d中获得的50 µl测量溶液转移到其他空孔中。
2. NADP / NADPH-Glo TM 检测基于发光的检测
  1. 向每个孔中加入50 µl NADP / NADPH-Glo检测试剂，并在微孔板摇床上短暂摇动板（轻轻地）。在黑暗中于室温（约23至25°C）孵育20分钟。
  2. 使用GloMax导航器系统检测并记录发光。将积分设置为每孔0.3 s。
    注意：5至10分钟后重复检测，并检查发光计数是否饱和。如果计数已饱和，请稀释测量溶液并重复检测步骤，以免低估了结果。

数据分析

需要使用标准曲线从发光单位（UI）计算NADP + 和NADPH数量。从该协议获得的值将代表测量溶液中NADP + 和NADPH分子的数量。在体外分析中，由于NADP + 减少。为了避免低估，为了计算活性，我们建议将NADP + 和NADPH量的总和作为nmol NADP / h / mg蛋白质或nmol NADP / h / g鲜重（FW）作为如下：

[NADP + 和NADPH的总和（nmol）]×[测量溶液的体积（µl）] / [用于检测的体积（50 µl）] / [反应时间（h）] / [蛋白量（毫克）或样品重量（克鲜重）]
与体外分析不同，通过叶盘法估算NAD + 激酶活性需要NADPH量，这仅仅是因为PETC从NADP + 。代表性的结果如图2所示。在完全黑暗的条件下，从未观察到NADP的增加（以NADP + 和NADPH之和表示）（图2A，黑暗）。此处，每个时间点的NADP + 和NADPH数量的计算如下：

[NADP + 和NADPH的总和（nmol）]×[测量溶液的体积（µl）] / [用于检测的体积（50 µl）] / [叶面积（cm 2 ）]
NADP含量也可以表示为nmol NADP mg − 1 叶绿素（Chl）或nmol NADP h − 1 g − 1 FW在测定之前，需要采取适当的措施（量化Chl的总含量或测量叶盘的重量）。
通常可以在30 s内检测到光驱动的NADP增加。在第一个约。10分钟后，光照下NADP的增加与时间成正比，如图2A所示。图2B说明了在照射开始时NADP的增加，以nmol NADP / g FW表示。因此，可根据以下公式计算叶绿体NAD激酶活性：

[NADP + 和NADPH的总和（nmol）]×[测量溶液的体积（µl）]×[60（min）] / [用于检测的体积（50 µl）] / [之后的时间曝光量（min）] / [样品重量（g）]

图2.光驱动的NADP增加。 A. NADP含量增加仅在光照下发生。B.早期NADP增加（至少5分钟）与时间成正比。在照明的前5分钟，直线拟合（虚线）的结果与曲线拟合（实线）的结果相当。
曲线拟合揭示了在不同时间点的一些合理的叶绿体NAD激酶活性（图3，实线）。如我们所见，初始活性估计超过50 nmol / h / g FW，但该活性在最初的几分钟内迅速下降，然后在约5分钟后缓慢下降。另一方面，简单的直线拟合显示了对叶绿体NAD激酶活性的代表性估计（图3，虚线）。基于叶盘中的蛋白质量，我们将NAD激酶活性表示为nmol / h / g FW和nmol NADP / h / mg蛋白。在以往的报告中，NADK2活性已被估计为约20至60纳摩尔/小时/克FW（5至15纳摩尔ħ - 1 毫克 - 1 蛋白）（高桥（ et al。，2006 and 2009），这与我们新开发的分析方法得出的估算值一致。

图3.叶绿体NAD激酶活性的估算。根据定量数据，NAD激酶活性以nmol / h / g FW和nmol / h / mg蛋白质估算。实线的值通过曲线拟合计算，而虚线下的值通过直线拟合计算。
除了NAD激酶的活性外，NADP的合成还受其他因素（例如NAD底物和ATP）的影响，因此我们相信，不仅体外，而且新开发的测定方法都将有助于推断在各种环境信号下哪些因素有条件地参与NADP合成的调控。

菜谱

蛋白质提取缓冲液
50 mM HEPES / KOH，pH 8.0
10毫米MgCl 2
1 mM CaCl 2
1 mM PMSF
每10毫升一瓶cOmplete TM 迷你蛋白酶抑制剂鸡尾酒
反应缓冲液
0.5 M HEPES / KOH，pH 8.0
100 mM氯化镁 2
萤光素检测试剂
在实验的早晨新鲜制备，并在约23至25°C下保存
重建缓冲液，包含在NADP / NADPH-Glo TM 分析试剂盒中
冻干萤光素，包含在NADP / NADPH-Glo TM 检测试剂盒中
NADP / NADPH Glo检测试剂
如上所述的萤光素检测试剂
还原酶，包含在NADP / NADPH-Glo TM 分析试剂盒中
还原酶底物，包含在NADP / NADPH-Glo TM 分析试剂盒中
NADP / NADPH-Glo TM 分析试剂盒中包含的NADP循环酶
NADP循环底物，包含在NADP / NADPH-Glo TM 分析试剂盒中

致谢

该协议是根据Takahashi等人（2009）和Hashida等人（2018）的先前工作进行改编和修改的。这项工作得到了MKY的JSPS KAKENHI资助号17H05714和19H04715的支持

利益争夺

作者宣称这里没有利益冲突。

参考文献

Berrin，JG，Pierrugues，O.，C。Brutesco，B.Alonso，J。Montillet，D。Roby和M.Kazmaier（2005）。 Stress诱导AtNADK-1的表达，AtNADK-1是在中编码NAD（H）激酶的基因>拟南芥。 Mol Genet Genomics 273（1）：10-19。
Chai，MF，Chen，QJ，An，R.，Chen，YM，Chen，J. and Wang，XC（2005）。 NADK2，一种拟南芥叶绿体NAD激酶，在两者中都起着至关重要的作用。叶绿素的合成和叶绿体的保护。植物分子生物学 59（4）：553-564。
Dell'Aglio，E.，Giustini，C.，Kraut，A.，Couté，Y.，Mazars，C.，Matringe，M.，Finazzi，G.和Curien，G.（2019）。钙调蛋白依赖性NAD + 激酶维持的鉴定激发子诱导的植物氧化爆发。 bioRxiv ：521658。
Delumeau，O.，Renard，M.和Montrichard，F.（2000）。纯化的钙调蛋白依赖性NAD的表征和可能的氧化还原调节<

植物细胞环境 23（11）：1267-1273。
SN桥田，伊丹市，肯塔基州高原市，平林市，河内宫市和河内山田市（2016）。 NAD代谢速率的提高通过加速拟南芥的发育衰老而缩短了植物的寿命。植物细胞生理学 57（11）：2427-2439。
SN的Hashida和M.的Kawai-Yamada（2019）。细胞间nad代谢是植物光响应性NADP动态的基础。 Front Plant Sci 10：960。
SN桥田，宫城A.，西山M.，吉田K.，Hisabori T.和河合山田（2018）。铁氧还蛋白/硫氧还蛋白系统在拟南芥。植物J 95（6）：947-960。
台，李，BB，聂，XM，张，PP，胡，CH，张，L，刘，WT，李，WQ和陈KM（2019）。钙调蛋白是植物中NADK介导的NAD信号传导的基本调节剂。 Front Plant Sci 10：681。
高桥，H.，高原，K.，桥田，SN，平林，T.，藤森，T.，川井山田，M.，Yamaya，T.，Yanagisawa，S.和Uchimiya，H.（2009）。在过量表达NAD激酶的拟南芥植物中碳和氮代谢的多向性调节基因。植物生理学 151（1）：100-113。
高桥（H.），渡边（A.），田中（A.），桥田（SN），河内山田（M.），佐野池（K.Sonike）和河内（Uchimiya）（2006）。叶绿体NAD激酶对于通过光合作用的叶黄素循环进行能量传递至关重要。 Plant Cell Physiol 47（12）：1678-1682。
Tezuka，T.和Yamamoto，Y.（1975）。通过植物色素对NAD激酶的光活化：磷酸盐供体和辅因子。植物生理学 56（6）：728-730。
特纳（WL），沃勒（Waller），JC，范德贝尔（Vanderbeld）和华盛顿州斯内登（Snedden）（2004）拟南芥中两个NAD激酶的克隆和表征。钙调蛋白结合同工型的鉴定。植物生理学 135（3）：1243-1255。