材料和试剂

带玻璃底部的µ-slide 8孔（Ibidi，目录号：80827）
细胞系：MDA-MB-231（ATCC，目录号：HTB-26）
L-15培养基（Thermo Fishers Scientific，目录号：11415049）
胎牛血清（FBS）（Thermo Fishers Scientific，目录号：A31605）
青霉素-链霉素（100x）（Thermo Fishers Scientific，目录号：15140122）
胰蛋白酶（0.25％）（Thermo Fishers Scientific，目录号：15050065）
DPBS（Thermo Fishers Scientific，目录号：14190250）
10x MEM（Thermo Fishers Scientific，目录号：11430030）
HEPES（Thermo Fishers Scientific，目录号：15630080）
胶原I（尾巴，4.41 mg / ml）（BD Biosciences，目录号354236）
纤连蛋白（5 mg）（FN）（Sigma，目录号：F1141）
MDA-MB-231培养基（请参阅食谱）
胶原-纤连蛋白凝胶混合物（请参阅食谱）

设备

相衬显微镜，具有20倍空气物镜，温度模块，CO 2 模块和自动聚焦模块（Zeiss Axio Observer显微镜）
37°C细胞培养培养箱
层流通风罩

软件

斐济：带有MTrackJ插件的ImageJ
注意：斐济：ImageJ，可以从 https：// imagej 下载软件。 net / Fiji / Downloads ，有关MTrackJ插件的信息，请访问 https://imagescience.org/meijering/software/mtrackj/ 。
Microsoft（MS）Excel 2007或更高版本

程序

按照食谱2中所述准备适当体积的胶原蛋白-纤连蛋白混合物。
每孔µ-Slide 8孔中加入100 µl凝胶混合物，使其在37°C下聚合1小时（图1A）。
注意：胶凝后，胶原纤连蛋白凝胶变成淡乳白色，并且胶原纤维均匀可见。
在此凝胶化期间，用胰蛋白酶消化细胞并计数。将细胞浓度设置为每毫升10 4 个细胞。
凝胶聚合后，将200 µl含细胞的培养基（ ie ，2,000个细胞）放在凝胶顶部。
将µ-slide 8放入37°C的培养箱中，并使细胞粘附在凝胶表面约2小时（图1A）。
细胞粘附后，轻轻除去培养基。这可以通过从µ-slide孔的角落缓慢吸出培养基来完成。
注意：此步骤很微妙。除去培养基时，必须格外小心，以免干扰凝胶和细胞。如果凝胶受到干扰/损坏，则不利于成像。
除去培养基后，将μ玻片放在层流通风橱中，并迅速重新制备胶原蛋白-纤连蛋白混合物。
将100 µl凝胶混合物放在附着于先前浇铸的凝胶的细胞顶部（图1A）。
在培养箱中于37°C孵育1小时，以使凝胶聚合。
注意：第二层凝胶凝胶化后，可以观察到在单个z平面中夹在两个凝胶之间的细胞。
同时，打开显微镜和显微镜载物台加热器。将温度调节至37°C。
第二层凝胶凝胶化后，在第二个凝胶的顶部添加150 µl完全培养基，以确保凝胶不会变干（图1A）。
小心地将µ-玻片放入设计用于固定玻片的显微镜插入物中，并进行温度，湿度和CO 2 控制。
将插入物放在显微镜载物台上。将焦点放在孔中心的单元格上。使用20倍物镜。使用具有相位对比的物镜（图1B）。
注意：µ-slide孔的中心最适合成像，以避免靠近孔侧面的像差。
以20分钟的间隔拍摄60小时的延时图像。

图1. 3D迁移设置中的步骤。 A.示意图概述了协议中涉及的步骤。B.夹在两个胶原-纤连蛋白凝胶之间的MDA-MB-231细胞的示例延时图像，描绘了其3D迁移过程中的细胞形态变化。比例尺：40 µm。有关3D迁移视频的示例性描述，请参阅Visweshwaran et al。，2018年，Movie EV2。

数据分析

视频采集完成后，分配图像属性。在斐济打开视频/图像堆栈文件，然后选择“图像”→“属性…”来分配图像属性，然后填写“长度单位”（示例-µm），“像素宽度”（像素大小以µm为单位），“像素高度”（像素大小，单位为µm）和“帧间隔”（20分钟）。保存视频/图像堆栈。也可以通过选择“分析”→“设置比例”选项来完成类似的分配。
如Dang和Gautreau，2018年以及Gorelik和Gautreau，2014年所述，完成了对细胞轨迹的手动跟踪和分析。简而言之，借助斐济软件插件“ MTrackJ”执行了手动跟踪，从而提供了轨迹数据。然后，将这些数据复制到包含DiPer定制宏套件的MS Excel文件中，以量化迁移参数。通过运行DiPer宏，可以计算并绘制各种迁移参数，如单元速度，方向持久性（方向自相关）和均方根位移（MSD），这些参数可用于制作出版物质量的数字（图2）。
对于这种设置，细胞轨迹的自动跟踪和分析也是可能的。Visweshwaran和Maritzen，2019年描述了一种合适的程序，该方法可以在实验人员只需最少的输入的情况下自动量化3D细胞迁移。
注意：加载了DiPer宏套件的MS Excel文件可以通过辅助文件：Excel_loaded_with_DiPer 。GoPerlik和Gautreau，2014年提供了有关DiPer以及迁移参数（如单元速度，方向持久性（方向自相关）和均方根位移（MSD））的详细说明。

图2。HSBP1耗尽的MDA-MB-231细胞的代表性3D迁移量化。请参阅Visweshwaran 等。（2018年）以获取详细信息。简而言之，顶部面板显示单细胞轨迹。均方位移（MSD）分析显示，与对照细胞相比，HSBP1耗竭的细胞探索的区域更小。这种影响可能是由于速度降低和方向持久性降低所致。在3个独立的实验中，每种条件下至少跟踪了10个细胞；数据是平均值±SEM；方差分析** P ＆lt; 0.01; **** P ＆lt; 0.0001。

笔记

当在Leibovitz的L-15培养基中培养MDA-MB-231细胞时，不应使用CO 2 进行pH控制。L-15培养基配方设计用于大气。在富含CO 2 的气氛中温育将对细胞有害。
为了运行宏来分析单元格轨迹，必须启用MS Excel中的“开发人员”选项卡。通过转到“ Excel选项”→“自定义功能区”→“自定义功能区”→“主选项卡”→“开发人员”，可以启用“开发人员”选项卡。
可以在此设置中研究药物/抑制剂对细胞3D迁移的影响。对于长期效果分析，可以在制造胶原纤连蛋白凝胶的同时添加药物，并在最后添加的介质中添加以防止凝胶干燥。在这种方法中，细胞会不断暴露于药物中，进行完整的观察。另一方面，还可以在3D迁移过程中添加药物/抑制剂。在这种方法中，应将高浓度的药物（1-10 µl）轻轻加入到凝胶顶部的培养基中，以防止凝胶干燥。在这里，药物会扩散到凝胶中。在这种情况下，实验人员最初会在没有药物治疗的期间记录3D细胞迁移，而在添加药物之后，则是在药物处理下3D细胞迁移的时期。如果药物/抑制剂有毒，用药物对细胞进行简短的预处理并将其夹在凝胶之间进行迁移分析也是一种替代方法。

菜谱

MDA-MB-231培养基
L-15培养基
10％FBS
1x青霉素-链霉素
胶原-纤连蛋白凝胶混合物
2 mg / ml胶原I
10 µg / ml FN
25 mM HEPES
10％FBS
1x MEM用无菌水完成
对于1毫升凝胶体积：
<身体>

10个MEM
100 µl

HEPES（1 M）
25 µl

胶原蛋白I（4.41 mg / ml）
452微升

FBS
100 µl

FN
10 µl

无菌水
313微升

致谢

该协议改编自Dang et al。（2013），并进行了修改。该协议的建立是由AG的团体资助资助的：国家研究机构（ANR ANR-15-CE13-0016-01），基金会癌症研究基金会（PGA120140200831）和国家癌症研究所（ INCA_6521）。SPV在最初的3年中获得了来自Ministèrede l'EnseignementSupérieuret de la Recherche的博士奖学金的支持，并在第四年获得了来自国立控制癌症中心的博士学位。

利益争夺

作者宣称他们没有利益冲突。

参考文献

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